《Experimental and Molecular Pathology》：NanoString nCounter? analysis of tissue microarray punch samples from colorectal carcinomas with invasive margins of the expansive and infiltrative type
编辑推荐：
通过经典方法，结直肠癌的浸润边缘可分为膨胀型或浸润型，后者预示预后不良。为深入了解这些形态学特征背后的肿瘤生物学，研究人员将18个可明确分为浸润型（N=7）或膨胀型（N=11）浸润边缘的微卫星稳定型结直肠癌提交至nanoString nCounter
通过经典方法，结直肠癌的浸润边缘可分为膨胀型或浸润型，后者预示预后不良。为深入了解这些形态学特征背后的肿瘤生物学，研究人员将18个可明确分为浸润型（N=7）或膨胀型（N=11）浸润边缘的微卫星稳定型结直肠癌提交至nanoString nCounter?分析（Tumor Signaling 360? Panel）。从肿瘤中获得组织微阵列穿刺样本，并在RNA提取前制备组织学切片。在基因表达数据的无监督聚类分析中，9个肿瘤（均为膨胀型）被归入簇1，所有7个浸润型边缘病例被归入簇2，该簇还包含2个膨胀型癌症。因此，浸润边缘类型在基因表达中得到反映；然而，肿瘤出芽（结直肠癌的第二种侵袭表型）并未得到反映。NanoString Annotation Scores在信号通路（转化生长因子β（TGFb）、血小板衍生生长因子（PDGF）、间充质-上皮转化因子（MET）、成纤维细胞生长因子受体（FGFR））、细胞外基质重塑和抗肿瘤免疫过程中具有显著性（p<0.05），但任何希望将两种侵袭表型背后的肿瘤生物学定位到一小部分基因的差异表达的希望均未实现。综上所述，数据确实为两种侵袭表型提供了分子基础，指出基质特征和抗肿瘤免疫是关键。尽管如此，研究人员未能获得更详细的工作机制洞察，这很可能归因于所用技术的普遍局限性。
**论文解读：结直肠癌膨胀型与浸润型浸润边缘的分子机制探索——基于NanoString nCounter
?技术的组织微阵列穿刺样本分析**
**研究背景与问题**
在结直肠癌（colorectal carcinoma, CRC）的病理学评估中，肿瘤浸润边缘的形态学分类是一个经典且具有预后意义的指标。约四十年前，Jass等提出将CRC的浸润边缘分为膨胀型（expansive-type）和浸润型（infiltrative-type），前者表现为大而紧密排列的肿瘤腺体、清晰的浸润边界及丰富的基质炎性反应，后者则呈小腺体散在分布、边界模糊，且基质呈瘢痕疙瘩样，缺乏炎性浸润，预后较差。然而，这一分类方法由于重复性争议（但通过专门训练可改善）以及近年来肿瘤出芽（tumor budding）作为预后标志的广泛关注而逐渐被边缘化。尽管形态学观察已揭示了两种浸润表型在肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）上的显著差异，但对其背后的分子生物学机制仍缺乏系统研究。既往研究多采用免疫组化（immunohistochemistry, IHC）定性分析细胞及基质成分，而高通量基因表达分析技术的应用尚属空白。因此，开展这项研究旨在利用NanoString nCounter
?技术大规模定量基因表达，探索膨胀型与浸润型浸润边缘的分子基础，并尝试将形态学特征与分子数据关联。
**研究内容与结论**
研究人员从2019年至2023年入组的CRC生物样本库中，选取18例微卫星稳定型（microsatellite-stable, MSS）CRC，经严格形态学确认后分为膨胀型（11例）和浸润型（7例）浸润边缘。采用组织微阵列（tissue microarray, TMA）穿刺样本（1.5 mm针芯）提取RNA，在提取前进行组织学切片（H&E、CK18、CD8、CD68免疫组化）以控制样本质量。通过NanoString nCounter
? Tumor Signaling 360
? Panel分析760个基因的表达，并运用ROSALIND
?软件进行无监督聚类、通路富集及差异表达分析。结果显示，无监督聚类将肿瘤分为两个主要簇：簇1包含9个肿瘤，全为膨胀型；簇2包含所有7个浸润型肿瘤及2个膨胀型肿瘤。这表明浸润边缘表型在基因表达水平上得到良好反映，但肿瘤出芽及瘤内出芽（intratumoral budding）并未影响聚类结果。通路分析（nanoString Annotation Scores）显示，在膨胀型与浸润型之间，差异表达基因显著富集于（i）基质受体与生长因子信号通路（转化生长因子β（TGFb）、血小板衍生生长因子（PDGF）、间充质-上皮转化因子（MET）、成纤维细胞生长因子受体（FGFR））及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑；（ii）肿瘤免疫相关通路（髓系免疫浸润、核因子κB（NFkB）信号、肿瘤抗原）；（iii）自噬；（iv）核因子E2相关因子2（Nrf2）与氧化应激。然而，差异表达基因的倍数变化较小，未能识别出少数关键基因的显著差异表达。此外，CD8+ T细胞及CD68+巨噬细胞密度在两组间无显著差异，但nCounter细胞毒性评分及T细胞共刺激评分在浸润型中明显降低。通过靶向二代测序（panel NGS）检测CRC常见突变基因，未发现突变状态与浸润表型的显著关联。
**主要技术方法**
研究采用NanoString nCounter
?技术（Tumor Signaling 360
? Panel）进行mRNA定量，该技术无需逆转录和DNA扩增，适用于福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）组织RNA。样本来源于德国罗斯托克大学病理研究所的CRC生物库（2019-2023年），经伦理委员会批准及患者知情同意。从代表肿瘤中心的FFPE蜡块中获取TMA穿刺样本（1.5 mm），提取RNA前进行H&E、CK18、CD8、CD68免疫组化及QuPath图像分析，以量化肿瘤区域、基质区域、T细胞及巨噬细胞密度。RNA提取后，使用CodeSet杂交、nCounter
? Prep Station及Digital Analyzer进行检测，数据通过ROSALIND
?软件分析，包括标准化、差异表达（阈值：倍数变化>1.5且p<0.05）及通路富集。此外，通过PCR及靶向NGS（AmpliSeq CRC v2 Panel）进行微卫星稳定性评估及突变检测。
**研究结果**
**3.1 聚类分析揭示浸润表型与基因表达模式的相关性**
对760个基因中的91个差异表达基因进行无监督二维聚类，将18个肿瘤分为两个主要簇：簇1仅含膨胀型肿瘤（9例），簇2包含所有浸润型肿瘤（7例）及2例膨胀型。这表明浸润边缘表型在基因表达水平上得到较好反映，但肿瘤出芽程度及瘤内出芽未影响聚类结果。
**3.2 通路分析识别关键生物学过程**
nanoString Annotation Scores显示，在膨胀型与浸润型之间，差异表达基因显著富集于：基质受体与生长因子信号（TGFb、PDGF、MET、FGFR）、ECM重塑、肿瘤免疫（髓系免疫浸润、NFkB信号、肿瘤抗原）、自噬及Nrf2/氧化应激。然而，任何单个基因的差异表达在两组间均非完全一致，提示浸润表型涉及多基因协同作用。
**3.3 免疫组化定量与免疫评分对比**
CD8+ T细胞及CD68+巨噬细胞密度在两组间无显著差异（p>0.05）。但基于nCounter数据的细胞毒性评分及T细胞共刺激评分在浸润型中显著低于膨胀型，表明浸润型肿瘤存在免疫抑制微环境。
**3.4 突变谱分析**
针对APC、TP53、KRAS、BRAF、SMAD4、ARID1A、PIK3CA等常见突变基因的NGS分析，未发现任何基因突变状态与浸润表型的显著关联（Fisher精确检验，p>0.05）。
**讨论与结论**
**讨论总结**：
本研究通过NanoString nCounter
?技术，从肿瘤中心穿刺样本（而非浸润边缘）中提取的RNA中，成功检测到膨胀型与浸润型浸润边缘在基因表达谱上的显著差异，且聚类结果与形态学高度一致，提示浸润表型的分子特征可能贯穿整个肿瘤。研究强调ECM重塑及抗肿瘤免疫是两种表型的关键差异，但未能识别出少数主导基因，差异表达倍数较小，反映出技术的局限性。作者指出，现有大规模基因表达分析面临数据处理复杂、样本微环境异质性难以控制等问题，导致结果重复性差。本研究的优势在于：假设驱动（明确检验形态表型与基因表达的关系）以及提取RNA前进行组织学质控（穿刺样本经H&E及IHC验证）。未来可扩展至更多样本、结合人工智能图像分析及更全面的免疫组化表征。
**结论翻译**：
总之，研究人员已证明，将组织微阵列穿刺样本提交至nanoString nCounter
?分析在形态-分子相关性研究中效果良好。这应是一种可推广至任何类型实体瘤研究的方法。就本研究所涉及的结直肠癌而言，数据确实为两种侵袭表型提供了分子基础，指出基质特征和抗肿瘤免疫是关键。然而，尽管研究人员在微环境方面尽可能做到精细（未达到单细胞表达研究或更复杂的生物信息学水平，即即将出现的“下一代技术”），仍未能获得更详细的工作机制洞察，这很可能归因于所用技术的局限性。
