基于超声脱细胞脊髓脑膜与亲水性丝素蛋白的酶促交联杂化水凝胶及其在神经组织工程中的应用

《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Enzymatically Crosslinked Hybrid Hydrogels from Ultrasound-Decellularized Spinal Cord Meninges and Hydrophilic Silk Fibroin for Neural Tissue Engineering

　　

兼具天然细胞外基质（extracellular matrix，ECM）生化复杂性与蛋白质基生物材料可调控特性的水凝胶，在神经组织工程中展现出良好前景。本研究将脱细胞脊髓脑膜（decellularized spinal cord meninges，dSCM）与水溶性亲水性丝素蛋白（hydrophilic silk fibroin，hSF）结合，并采用辣根过氧化物酶/过氧化氢（horseradish peroxidase/hydrogen peroxide，HRP/H₂O₂）体系进行酶促交联，以构建复合水凝胶。无表面活性剂、超声辅助脱细胞方法可有效去除细胞成分，同时保持基质完整性，使残余双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）降低至低于50 ng mg^?1干重，并保留包括胶原与糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）在内的关键ECM组分。按不同dSCM:hSF比例制备的水凝胶呈现出成分依赖性的结构与力学行为，其中1:0.5和1:1配方表现出最有利的压缩刚度与黏弹学性能。进一步的结构、热学及形貌学分析表明，hSF的引入提高了基质稳定性，并有助于实现更可控的溶胀与降解行为。生物学评价显示，1:0.5配方在绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）实验中促进了新生血管形成，且未见明显不良炎症反应。此外，SH-SY5Y细胞保持较高活性，并随时间推移表现出神经元相关标志物β-III微管蛋白（β-III tubulin）和微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）表达升高。总体而言，这些结果提示，dSCM:hSF水凝胶为神经组织工程提供了一个具有应用前景的平台。

该研究发表于《ACS Biomaterials Science 》。论文围绕神经组织工程支架材料中“生物活性与力学稳定性难以兼顾”的关键问题展开。天然细胞外基质（extracellular matrix，ECM，细胞外微环境支撑网络）来源支架因保留原生生化信号而具有良好组织仿生性，但常见脱细胞工艺依赖十二烷基硫酸钠等去污剂，容易破坏胶原纤维结构、损伤层粘连蛋白（laminin）和纤连蛋白（fibronectin）等活性成分，并残留潜在细胞毒性物质。对于神经修复而言，脊髓脑膜富含胶原和蛋白聚糖，既参与神经保护与血管组织，也与再生信号密切相关，是较有潜力的ECM来源。然而，单纯ECM水凝胶通常存在机械强度不足、降解过快和操作性较差等局限，限制了其在植入和体外培养中的应用。基于此，研究人员尝试将超声辅助脱细胞获得的脊髓脑膜ECM与亲水性丝素蛋白（hydrophilic silk fibroin，hSF）复合，并通过辣根过氧化物酶/过氧化氢（HRP/H₂O₂）酶促交联构建杂化水凝胶，以期在保留脑膜ECM生物学相关性的同时，提升材料的结构稳定性、力学性能及生物学适配性。

研究的总体思路包括两个层面：其一，建立无去污剂的超声辅助脱细胞策略，尽可能在清除细胞成分的同时保留基质超微结构；其二，利用hSF与ECM蛋白中的酪氨酸残基，通过HRP/H₂O₂介导形成二酪氨酸（dityrosine）交联网络，构建可调控的复合水凝胶。结果表明，该策略成功制备出不同配比的dSCM:hSF水凝胶，且材料的结构、力学、流变、溶胀、降解、血管生成反应及细胞响应均呈现明确的成分依赖性。综合而言，1:0.5配比在压缩刚度、孔结构、溶胀能力、CAM血管生成和神经相关基因表达方面最为均衡；1:1配比则在流变学黏弹性指标方面表现最佳。该研究的重要意义在于，为神经组织工程提供了一种兼具ECM来源生物活性与蛋白质基材料可调性的复合支架构建路径，并证明适度引入hSF而非单纯提高其比例，更有利于形成性能均衡的神经修复候选材料。

研究人员采用的主要技术方法包括：以屠宰场来源牛脊髓脑膜为原料，应用低渗/高渗处理联合超声辅助、核酸酶消化及过氧乙酸/乙醇去污染的无去污剂脱细胞工艺；通过胃蛋白酶消化dSCM并与hSF按不同比例混合，采用HRP/H₂O₂体系酶促交联制备水凝胶；利用dsDNA、羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）、硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycan，sGAG）、电泳、组织学染色、压缩测试、流变学、ATR-FTIR、TGA、XRD、SEM、BET、溶胀和体外降解实验进行理化表征；采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验评价血管生成与短期相容性，并以SH-SY5Y细胞进行Live/Dead、MTS、RT-qPCR及免疫组织化学分析。

在“3.1. Evaluation of the Decellularization Process”部分，研究人员比较了去污剂法和超声辅助法对脊髓脑膜脱细胞的效果。定量结果显示，天然脊髓脑膜（nSCM）中dsDNA为521.3 ± 0.7 ng mg^?1干重，去污剂法和超声法分别降至12.9 ± 0.7和34.5 ± 2.7 ng mg^?1，均低于常用脱细胞合格阈值50 ng mg^?1。HYP与sGAG含量在脱细胞后未降低，提示胶原和糖胺聚糖等关键ECM成分得到保留。琼脂糖凝胶电泳显示脱细胞样本中高分子DNA条带消失，SDS-PAGE则显示超声法样本保留了I型胶原α₁、α₂及β链相关条带。H&E、Alcian Blue和Sirius Red染色进一步证实细胞残留已被去除且富GAG和富胶原区域得以保存。扫描电镜结果显示，超声法较去污剂法更好保留了纤维化、连续性和互联性的基质超微结构。因此，研究确立了超声辅助脱细胞dSCM-US作为后续水凝胶构建的更优ECM来源。

在“3.2. Enzymatic Crosslinking and Proposed Network Formation of dSCM and dSCM:hSF Hydrogels”部分，研究人员提出了酶促交联网络形成机制。对于仅含dSCM的体系，脑膜ECM中的含酪氨酸蛋白如层粘连蛋白、纤连蛋白和弹性蛋白（elastin）可作为HRP/H₂O₂氧化偶联底物，形成二酪氨酸共价桥，从而稳定天然ECM网络。引入hSF后，丝素蛋白额外提供含酪氨酸位点，促进ECM蛋白与丝素链段之间形成更整合的杂化网络。论文认为，除共价二酪氨酸键外，丝素蛋白的次级物理相互作用也有助于网络稳定。该部分的核心结论是：超声脱细胞保留的ECM蛋白和纤维组织为后续酶促交联提供了化学基础，而hSF的加入则增强了网络凝聚性和整体完整性。

在“3.3. Mechanical Properties and Rheological Behavior of dSCM:hSF Composite Hydrogels”部分，研究人员通过压缩测试与流变学系统分析不同hSF比例对水凝胶力学行为的影响。压缩结果显示，1:0.5组的断裂前应力和杨氏模量最高，约为250–270 kPa；1:1组也保持较高刚度，约220–230 kPa；1:2和1:3组则明显降低；1:0组整体最软。预实验还显示，随着HRP浓度由10 U mL^?1升至20和30 U mL^?1，压缩应力逐步增强，因此后续采用20 U mL^?1。流变学结果表明所有组别的储能模量（G′）均高于损耗模量（G″），说明材料以弹性响应为主。1:1组G′最高，提示在振荡载荷下具有更强的黏弹网络稳定性。阶跃应变恢复测试显示，1:1和1:2组在高应变后G′恢复更明显，表明其抗形变和结构重建能力较好。该部分说明，中等比例hSF能够优化dSCM水凝胶的承载、黏弹和恢复行为，但过量hSF并不会持续增强网络，反而可能因组织异质性增加而削弱力学优势。

在“3.4. Structural and Physicochemical Characterization of dSCM:hSF Composite Cryogels”部分，ATR-FTIR、TGA/DTG和XRD被用于分析复合冻胶的分子结构与热稳定性。ATR-FTIR显示各组均保留典型蛋白质酰胺带，包括Amide A、Amide B及Amide I–III区，说明交联后蛋白骨架结构整体保持。随着hSF含量升高，酰胺带强度和位置发生变化，特别是Amide I向低波数偏移，提示更有序的丝素构象贡献增加。TGA/DTG显示各组均经历类似三阶段降解过程，但含hSF组在高温下残余质量更高，热稳定性有所改善。XRD结果显示所有样品以宽弥散峰为主，提示整体仍以非晶态结构为主，高hSF组仅见轻微峰形变化，并未形成明显高结晶域。因此，hSF的引入提高了复合体系的稳定性，但未显著改变其以无定形蛋白网络为主的结构特征。

在“3.5. Morphology, Porosity, Swelling Behavior, and Wettability of dSCM:hSF Composite Cryogels”部分，研究人员考察了hSF比例对孔结构和水化行为的调控作用。扫描电镜显示，1:0组呈相对疏松的层片状多孔结构；加入hSF后内部结构更致密有序，其中1:0.5组形成高度互联、孔洞较大且较圆整的网络，1:1和1:2组则进一步致密化，孔径逐步缩小。定量分析显示平均孔径由1:0.5组的98.21 μm降至1:1组的66.02 μm和1:2组的51.92 μm。BET结果提示1:0组比表面积最高，而含hSF组显著降低，反映微孔/介孔可及性下降。溶胀实验显示1:0.5组吸液能力最高，甚至高于纯dSCM组，而更高hSF比例使溶胀率逐步下降。接触角观察也表明，hSF含量越高，表面液滴铺展越慢、表观润湿性越低。该部分的结论是：适量hSF，尤其1:0.5比例，可在保持开放孔结构的同时增强吸液与界面相互作用；过高比例则导致网络致密化和水化能力下降。

在“3.6. In Vitro Degradation Behavior of dSCM:hSF Composite Cryogels”部分，论文比较了各组在PBS中的14 d水解降解行为。所有组别均表现为时间依赖性失重，14 d均高于7 d。7 d和14 d时，1:0组失重最低，1:2和1:3组最高，1:0.5组则低于高hSF组且同时维持较好力学表现。该结果表明，在本体系中，hSF含量增加并未提高水解稳定性，反而可能因网络组织效率下降而促进水分进入和结构松散。中等比例的hSF则在稳定性和力学完整性之间提供了更合理的平衡。

在“3.7. In Ovo CAM Evaluation of Angiogenic Response and Biocompatibility of dSCM:hSF Composite Hydrogels”部分，研究人员利用CAM模型评估血管生成和短期生物相容性。所有植入水凝胶在EDD7至EDD11期间均保持原位，说明具备基本结构稳定性。定量分析显示，VEGF阳性对照的血管指数最高；在各水凝胶中，1:0.5组血管指数最高，其次为1:1和1:2，PBS组最低。组织学可见植入区周围形成含血液的新生血管结构，且1:0.5组更为明显。植出样本扫描电镜显示所有组别表面均与CAM组织发生接触并附着细胞/组织成分，1:0.5组表面更开放，更利于组织整合。研究据此认为，水凝胶成分显著影响血管反应，其中1:0.5组由于兼具较有利的孔结构和dSCM生物活性，表现出最佳促血管生成能力，且未见明显出血、坏死或严重刺激反应。

在“3.8. Cell Viability, Proliferation, and Neuronal-Associated Gene Expression on dSCM:hSF Hydrogels”部分，研究人员采用SH-SY5Y细胞评价材料细胞相容性及神经相关转录反应。Live/Dead染色显示所有组别在第2天和第7天均以绿色活细胞信号为主，红色死细胞信号较少，说明材料毒性较低。第7天时细胞数量和空间分布较第2天增加，1:1组分布更均一，1:0.5组也有较高密度活细胞存在。MTS结果显示，无论组织培养板对照还是1:0、1:0.5、1:1组，第7天代谢活性均较第2天显著升高，且第7天三种水凝胶组之间无显著差异。RT-qPCR进一步显示，多数组别中β-III tubulin和MAP2表达随时间上升，其中1:0.5组在第7天对两种标志物的上调最为显著；1:1组MAP2升高，但β-III tubulin变化未达统计学显著。论文特别指出，因未实施诱导分化方案，这些结果应解释为神经相关基因表达得到维持或增强，而非直接证明神经元分化被诱导。

在“3.9. Histological and Immunohistochemical Evaluation of SH-SY5Y Cells on dSCM:hSF Hydrogels”部分，H&E和甲苯胺蓝染色证明SH-SY5Y细胞在培养第2天和第7天均存在于各组水凝胶内部，并沿支架内表面附着分布，第7天细胞密度普遍更高。1:0.5和1:1组表现出较1:0组更连续的细胞分布。β-III tubulin和MAP2免疫组织化学染色进一步证实细胞在水凝胶中保持神经相关标志物阳性，且第7天染色强于第2天，尤以1:0.5和1:1组更为明显。该部分与RT-qPCR结果相互印证，进一步支持材料对细胞存活和神经相关表型维持的支持作用。

讨论部分表明，本研究的核心发现是：无去污剂超声脱细胞方法在满足脱细胞标准的同时，更好地保留了脊髓脑膜ECM的组织架构，为后续构建功能性神经支架奠定基础；hSF的复合并非“越多越好”，而是存在明显比例窗口，中等添加量能够在ECM生物活性、网络稳定性、孔结构开放性、压缩刚度、黏弹恢复、血管生成和神经相关细胞反应之间建立更优平衡。结果也提示，材料性能由多因素共同决定，不仅取决于是否增加丝素蛋白，还受交联效率、网络组织方式、孔隙连通性及水化特性的共同影响。因此，针对神经组织工程这类既需要细胞支持又依赖局部血管反应的应用场景，1:0.5配比显示出最具综合优势的候选价值。

研究结论部分可译为：本研究通过HRP/H₂O₂介导的酶促交联，在无去污剂脱细胞脊髓脑膜基础上成功构建了杂化dSCM:hSF水凝胶。该策略将脑膜细胞外基质的生物学相关性与亲水性丝素蛋白可调控的结构贡献相结合，使所得复合水凝胶表现出成分依赖性的理化、力学和生物学特性。脱细胞过程有效去除了细胞物质，同时保留了主要ECM组分和结构特征，支持将dSCM作为具有生物学意义的基质来源。随后引入hSF显著影响了水凝胶性能，且结果一致表明，中等dSCM:hSF比例表现出最均衡的综合行为。具体而言，1:0.5配方具有最高压缩刚度、较高溶胀能力、有利孔结构以及CAM实验中最强的血管生成反应，而1:1配方在流变学评价中表现出最高黏弹响应。相反，较高hSF比例与刚度下降、溶胀减弱和血管反应变弱相关，说明过量丝素蛋白并不能进一步改善整体支架性能。生物学分析进一步证明，所构建水凝胶具有细胞相容性，并支持SH-SY5Y细胞在培养期间存活及维持代谢活性。在所测试组别中，1:0.5配方引起β-III tubulin和MAP2表达最明显升高，提示该组成在既定培养条件下为神经相关细胞反应提供了更有利的微环境。同时，CAM实验确认了材料可接受的短期生物相容性，并进一步表明支架组成对血管反应具有显著影响。总体而言，本研究表明，无去污剂dSCM与hSF可用于构建经酶促交联的杂化水凝胶，其结构与生物学性能可调。在所测试配方中，1:0.5组成在结构性质、血管生成反应和神经相关细胞活性之间展现出最佳总体平衡，是后续作为神经组织工程生物材料平台开展深入研究的有前景候选。