循环外泌体miRNA独特表达谱与中枢神经系统(CNS)病变的相关性研究

《Frontiers in Immunology》：Unique expression pattern of circulating exosomal miRNA correlates with CNS pathology

　　

背景与目的：探讨两种不同中枢神经系统(CNS)病理状态——自身免疫性脱髓鞘和创伤性脑损伤(TBI)动物模型中循环外泌体(exosome)总转录组特征。方法：采用二代测序(NGS)分析MOG肽诱导的EAE小鼠模型及TBI小鼠模型血清外泌体的全局RNA谱，每样本分析约500万条读段(read)，详细分析EAE versus对照组及EAE versus TBI模型中差异表达的microRNA(miRNA)。结果：外泌体RNA NGS检出包括miRNA在内的10类转录本。EAE和TBI小鼠外泌体中miRNA数量较对照组呈下降趋势。差异表达miRNA见于EAE三个连续时间点：免疫后早期(EAEp)、疾病高峰期(EAEa)和恢复期(EAEl)。EAE与TBI差异表达miRNA模式与其参与免疫应答激活或抑制相关。EAE早期miR-335-5p和miR-411-5p较TBI上调；疾病高峰期为miR-27a-3p、miR-141-3p、miR-27b-3p、miR-195a-5p、miR-21a-5p和miR-99a-5p显著上调；恢复期为miR-27b-3p、miR-141-3p、miR-27a-3p、miR-127-3p、miR-429-3p和let-7b-5p上调，与抑制免疫反应及增强免疫调节相关。EAE各期均出现相对于TBI的一致miRNA下调模式。最显著差异表达miRNA靶基因生物信息学分析显示多个参与EAE和TBI神经炎症的蛋白。EAE早期Hdac9、Syt7和NT5c2为控制T细胞命运和细胞因子产生的表观遗传开关；恢复期Rorb(ROR核受体家族成员，参与Th17分化)受抑制。讨论：不同CNS病理类型(自身免疫脱髓鞘vs TBI)伴随循环外泌体miRNA差异化表达模式，提示其在两类CNS病变中具有不同的作用。

论文解读：循环外泌体miRNA独特表达谱与中枢神经系统(CNS)病变的相关性

本研究发表于《Frontiers in Immunology》。目前关于不同机制所致中枢神经系统(CNS)病变——如自身免疫性脱髓鞘与机械性创伤性脑损伤(TBI)——中循环外泌体(exosome)所携带microRNA(miRNA)表达谱的差异及其表观遗传调控意义尚不清楚。miRNA作为重要的转录后调控非编码RNA，可通过外泌体在细胞间传递并影响靶基因表达，参与神经炎症(neuroinflammation)的调节，但不同CNS病理条件下循环外泌体miRNA全景图谱是否具有特异性有待阐明。为此，研究人员比较了MOG_35-55诱导的慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型与闭合性TBI小鼠模型中血液循环外泌体的miRNA表达谱，通过二代测序(NGS)鉴定差异表达miRNA并预测其靶基因，以明确不同CNS病变的外泌体miRNA特征及其潜在免疫调控功能。研究发现EAE与TBI小鼠循环外泌体miRNA数量和表达模式均显著低于健康对照，且EAE与TBI之间存在截然不同的miRNA差异表达谱，EAE各病程阶段差异表达miRNA与其免疫激活或免疫抑制功能相符，靶基因富集于神经炎症相关通路。该结果表明循环外泌体miRNA可作为区分自身免疫性脱髓鞘与机械性脑损伤的潜在表观遗传标志物，并为理解不同CNS炎症类型的表观调控机制提供依据。

主要技术方法：

研究人员使用C57BL/6小鼠建立MOG肽诱导的EAE模型（取免疫后第6天早期EAEp、第12天高峰EAEa、第40天恢复EAEl三个时间点）及电磁冲击闭合性TBI模型（伤后3个月TBI3m和6个月TBI6m），以假手术/未免疫小鼠为对照。自小鼠全血中以聚合沉淀法(ExoQuick kit)分离循环外泌体，经纳米颗粒示踪分析(NTA)及外泌体标志蛋白Alix(Western blot)鉴定。提取外泌体总RNA并构建小RNA文库，在Illumina NextSeq 500平台上行NGS。数据以bowtie及miRDeep2比对至小鼠参考基因组GRCm38.p6及miRBase v22.1(mmumiRNA)，用edgeR进行差异表达分析(FDR<0.05，p<0.05)。miRNA靶基因预测采用miRWalk 3.0数据库(P<0.05)。

研究结果

NGS of the exosome RNA content（外泌体RNA成分的新一代测序）：

研究人员对EAE及TBI小鼠血清外泌体行RNA-seq，平均每样本约500万条比对读段，共鉴定222528条miRNA序列涵盖652种miRNA物种，外泌体中还含tRNA、piRNA、rRNA、lncRNA、mRNA、snRNA、yRNA、scRNA等10类RNA。对照组外泌体miRNA序列数最高(74922条)，EAE各期(43497~36561条)及TBI(14414~18494条)均低于对照，尤以TBI降低显著，提示病理状态下循环外泌体miRNA含量总体下降。

Exosomal miRNA expression pattern in EAE（EAE中外泌体miRNA表达模式）：

分析EAE三个时间点vs对照组差异表达miRNA发现，早期(EAEp)上调和下调miRNA数量最多，表明EAE起始阶段即发生显著的循环外泌体miRNA重编程；高峰期(EAEa)和恢复(EAEl)也有各自特异的上调/下调miRNA组合，反映miRNA随自身免疫进程动态演变并可能参与疾病诱导、峰值及缓解的表观调控。

Exosomal miRNA pattern expression in TBI models（TBI模型中外泌体miRNA表达模式）：

TBI 3个月和6个月外泌体miRNA整体较对照显著降低，差异表达miRNA数量多于EAE。两个时间点共享大量上调和下调miRNA，提示TBI后miRNA依赖调控具长期持续性，且机械性脑损伤引起更广泛的外泌体miRNA改变。

Significant difference in exosomal miRNA expression pattern between EAE and TBI models（EAE与TBI模型间外泌体miRNA表达模式的显著差异）：

EAE各期循环外泌体miRNA总量高于TBI。EAE早期(EAEp) vs TBI仅2个miRNA上调(miR-335-5p、miR-411-5p)，高峰期(EAEa)有14个(含miR-27a-3p、miR-141-3p、miR-27b-3p、miR-195a-5p、miR-21a-5p、miR-99a-5p等)，恢复期(EAEl)有15个(含miR-27b-3p、miR-141-3p、miR-27a-3p、miR-127-3p、miR-429-3p、let-7b-5p等)；其中miR-27a-3p、miR-141-3p、miR-27b-3p在EAEa和EAEl共同上调。EAE vs TBI下调miRNA较少，miR-142a-3p、miR-144-3p、miR-486a-5p、miR-486b-5p、miR-10a-5p在EAE三时间点一致低表达，说明EAE相对TBI选择性miRNA下调有限。

Identification of the spectrum of transcript targets for circulating exosomal miRNAs（循环外泌体miRNA靶转录本谱鉴定）：

生物信息学预测最显著差异表达miRNA靶基因显示大量转录及DNA互作因子。EAE早期上调miRNA靶基因为Hdac9、Syt7、Nt5c2(与T细胞命运及细胞因子产生表观开关相关)；EAE恢复期上调miRNA靶基因为Rorb(ROR核受体家族，参与Th17分化)。EAE vs TBI下调miRNA靶基因为Elavl2和Usp3(分别关联神经元RNA稳定及固有免疫去泛素化)。表明差异外泌体miRNA可能通过调控上述靶基因参与EAE和TBI的神经炎症过程。

讨论与结论：

研究人员总结认为，循环外泌体携带完整的多类RNA转录组，其miRNA含量在EAE和TBI中均较对照降低。EAE外泌体miRNA随病程动态变化，早期即参与自身免疫启动，后期具免疫调节特征；TBI外泌体miRNA改变具长期稳定性且幅度更大。EAE与TBI间外泌体miRNA差异表达模式截然不同，EAE中上调miRNA(如miR-27a-3p、miR-141-3p)与免疫抑制/调节相关，持续低表达者(如miR-142a-3p、miR-144-3p)与抗原提呈及促炎细胞因子调控相关，符合其分别在免疫活化或抑制中的作用。靶基因分析证实差异miRNA可作用于神经炎症相关分子(Hdac9、Rorb等)。因此，不同类型CNS病理(自身免疫脱髓鞘与TBI)伴随特征性循环外泌体miRNA表达谱，提示其反映不同表观遗传通路并可能作为区分免疫性与非免疫性神经炎症的潜在生物标志物(biomarker)。