《Frontiers in Immunology》：CircZFYVE1 functions as a competitive endogenous RNA to enhance LSM14A-mediated antiviral defense against influenza A virus
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引言：环状RNA（circRNAs）是共价闭合的内源性RNA，在转录后水平调控基因表达，并已被证明参与抗病毒免疫。然而，它们在甲型流感病毒（IAV）感染过程中的功能作用和调控机制仍不完全清楚。
方法：研究人员利用RT-qPCR在时间梯度和剂量反应条件下，检测了
引言：环状RNA（circRNAs）是共价闭合的内源性RNA，在转录后水平调控基因表达，并已被证明参与抗病毒免疫。然而，它们在甲型流感病毒（IAV）感染过程中的功能作用和调控机制仍不完全清楚。
方法：研究人员利用RT-qPCR在时间梯度和剂量反应条件下，检测了IAV WSN株感染的A549细胞中circZFYVE1的表达。通过miRNA靶标预测、荧光素酶报告基因实验以及评估其作为竞争性内源RNA（ceRNA）作用及其对先天抗病毒信号影响的功能实验，研究了circZFYVE1的机制功能。
结果：在WSN感染后，circZFYVE1的表达以时间和剂量依赖性方式被诱导。从机制上讲，circZFYVE1通过海绵吸附hsa-miR-4435作为ceRNA，从而解除miRNA对加工体相关蛋白LSM14A的抑制，并增强感染期间的先天抗病毒信号传导。
讨论：这些发现定义了一个连接IAV感染与先天抗病毒反应的circRNA-miRNA-mRNA调控轴，为circRNA介导的宿主防御提供了新见解。circZFYVE1/LSM14A通路代表了未来旨在调节内源性抗病毒免疫研究的潜在靶点。
甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）是重要的人畜共患病原体，其快速突变和基因重配导致疫苗与药物效果受限，亟需深入理解宿主抗病毒免疫的调控网络。环状RNA（circRNA, 共价闭合的非编码RNA）在免疫调控中发挥关键作用，但IAV感染中circRNA的功能和机制尚不完全清楚。LSM14A（加工体相关蛋白，又称RAP55）是识别病毒核酸并激活IFN-β产生的胞质传感器，其转录后调控机制不明。研究人员依托《Frontiers in Immunology》发表论文，通过RNA测序和功能实验鉴定了一个IAV诱导的环状RNA——circZFYVE1（来源于ZFYVE1基因第2外显子），并揭示其作为竞争性内源RNA（ceRNA, 通过海绵吸附miRNA调控基因表达）增强LSM14A介导的抗病毒防御。
本研究主要使用A549（人肺癌上皮细胞）、MDCK（犬肾细胞）和HEK293T（人胚胎肾细胞）；病毒株包括A/WSN/33(H1N1)、A/Hong Kong/1/68(H3N2)和禽源A/chicken/Anhui/LH99/2017(H9N2)（产自SPF鸡胚）。关键方法包括：RT-qPCR定量表达；RNase R抗性实验验证环状结构；核质分离确定定位；双荧光素酶报告实验检测miRNA结合与启动子活性；Ago2 RNA免疫沉淀（RIP）和生物素标记miRNA pull-down验证RNA互作；siRNA敲低与质粒过表达进行功能研究；Western blot检测蛋白；噬斑测定病毒滴度。
1. IAV感染细胞中circZFYVE1的鉴定与表达特征：通过RT-PCR和Sanger测序确认circZFYVE1具有特异性反向剪接位点；RNase R抗性实验证实其环状稳定性；核质分离显示其主要定位于细胞质。IAV WSN株以时间和剂量依赖性方式诱导circZFYVE1表达，H3N2亚型感染也显著诱导其表达，H9N2感染呈上升趋势但未达统计学意义。2. circZFYVE1限制IAV在A549细胞中的复制：使用靶向反向剪接位点的siRNA敲低circZFYVE1后，WSN和H3N2病毒滴度显著升高；过表达circZFYVE1（强外源条件）在24小时降低病毒滴度和NP蛋白水平。3. circZFYVE1是病毒诱导的宿主因子且功能独立于亲本基因：IAV感染导致ZFYVE1前体mRNA和circRNA积累，但线性成熟mRNA水平不变，circRNA与线性mRNA比例升高；敲低或过表达circZFYVE1不影响线性ZFYVE1 mRNA水平。4. circZFYVE1在测试条件下无蛋白编码活性：预测的开放阅读框（ORF）编码产物具有抗病毒活性，但circZFYVE1表达质粒未检测到FLAG标签蛋白，支持其以非编码机制为主。5. circZFYVE1作为miR-4435的海绵发挥作用：Ago2 RIP富集circZFYVE1；生物素标记的miR-4435 pull-down直接捕获circZFYVE1；双荧光素酶实验验证miR-4435特异性结合circZFYVE1互补位点；功能实验显示miR-4435促进IAV复制，而抑制miR-4435减少病毒产量。6. circZFYVE1作为ceRNA调控miR-4435/LSM14A介导的抗病毒反应：qPCR筛选和双荧光素酶实验证实miR-4435直接靶向LSM14A 3'UTR；Western blot显示miR-4435抑制而circZFYVE1增强LSM14A-3'UTR报告基因表达；circZFYVE1的抗病毒作用可被miR-4435部分逆转；在circZFYVE1敲低细胞中外源LSM14A表达部分恢复抗病毒功能；circZFYVE1增强IFN-β和ISRE启动子活性及IFN-β和ISG15 mRNA表达。
讨论部分指出，circZFYVE1的诱导独立于线性ZFYVE1表达，且无明显蛋白编码活性，支持其以ceRNA机制为主；但该作用受分子相对丰度影响，外源过表达条件与生理水平的差异需后续以内源体系验证；LSM14A部分挽救效应提示可能存在其他参与机制。结论：研究人员将circZFYVE1鉴定为一种先前未知的、IAV诱导的环状RNA，其通过至少部分涉及miR-4435和LSM14A的竞争性内源RNA机制限制IAV复制，支持抗病毒信号传导。这些发现强调circRNA-miRNA-mRNA调控网络在宿主-病原体相互作用中的功能重要性，并提示circZFYVE1/miR-4435/LSM14A轴可作为未来宿主导向抗病毒反应研究的潜在靶点。
