《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A biomimetic and xeno-free platform for corneal engineering: synergy between PRGF technology and human dental pulp stem cells
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摘要：背景：尽管角膜是移植最广泛的实体组织之一，但估计约98%需行移植的患者无法获得这一挽救视力的手术。这一关键缺口是全球供体严重短缺的直接后果，凸显了对生物工程替代物的迫切需求。尽管已有大量研究，构建功能性生物工程角膜仍是重大挑战。本研究探讨了一种新颖的仿生
摘要：背景：尽管角膜是移植最广泛的实体组织之一，但估计约98%需行移植的患者无法获得这一挽救视力的手术。这一关键缺口是全球供体严重短缺的直接后果，凸显了对生物工程替代物的迫切需求。尽管已有大量研究，构建功能性生物工程角膜仍是重大挑战。本研究探讨了一种新颖的仿生方法，即利用富血小板生长因子(Plasma Rich in Growth Factors, PRGF)技术联合牙髓干细胞开展角膜组织工程。材料与方法：分离、鉴定人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)，并将其诱导分化为角膜上皮、基质及内皮层表型。根据所包埋hDPSCs的分化阶段构建了两类角膜移植物。生物工程构建物由中央包埋细胞的生物活性PRGF-纤维蛋白(fibrin)核心夹于三层前层与后层细胞片之间组成。PRGF来源上清用作培养基补充物。评估所得角膜替代物的光学与流变学性质及细胞活力。最后组织学检测并量化生物工程移植物的结构稳定性与重塑动力学。结果：含未分化hDPSCs的角膜移植物表现出更优的弹性与透明度，且制备后维持更高细胞密度。此类构建物质量减少更显著，伴随加速的纤维蛋白降解及增强的新胶原(de novocollagen)合成。结论：由中央PRGF膜-纤维蛋白核心整合hDPSCs以模拟复制角膜三层细胞架构的生物工程移植物，是未来角膜移植术中具动态仿生潜力的候选物。
本文解读对象为发表于《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》的研究论文"A biomimetic and xeno-free platform for corneal engineering: synergy between PRGF technology and human dental pulp stem cells"。
【研究背景与意义】
全球角膜供体严重短缺致使约98%需角膜移植患者无法接受手术，开发功能性生物工程角膜替代物具有重要临床需求。现有支架材料（纯胶原力学差、脱细胞基质批次差异大、合成聚合物缺乏信号分子）与细胞源（原代角膜细胞来源受限）均存在局限。富血小板生长因子(Plasma Rich in Growth Factors, PRGF)是自体外周血制备的富含生长因子与信号分子的纤维蛋白基质，具备天然促再生与低免疫原性；人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)源于胚胎神经嵴(neural crest)，具多向分化潜能且获取微创。本研究旨在构建一种无异种(xeno-free)仿生角膜替代物——以PRGF纤维蛋白膜(mPRGF)为核心支架包埋hDPSCs模拟角膜基质，上下贴合温度响应培养收获的细胞片模拟上皮与内皮层，并以PRGF上清替代胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)，评估未分化与预分化hDPSCs对移植物光学、力学、细胞活力及基质重塑的影响。
【主要关键技术方法】
研究人员取自健康14岁捐赠者阻生第三磨牙，采用组织块法原代培养hDPSCs，经流式细胞术检测间充质标志物（CD73、CD90、CD105阳性；CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性）及三系（成骨、成脂、成软骨）分化鉴定其干细胞特性。采集两名健康供体静脉血按厂商方案制备PRGF上清（替代FBS）与PRGF纤维蛋白膜(mPRGF)（经氯化钙激活、离心取上清或铸模成型后用环钻裁为直径13.0 mm）。hDPSCs分别在含5% PRGF上清的专用诱导培养基中向角膜上皮（SHEM＋EGF等）、基质（抗坏血酸-2-磷酸＋bFGF＋TGF-β3）及内皮（先神经定向21 d再内皮诱导含Activin A等）表型诱导，并以Pan-Cytokeratin(PanCK)、Lumican(LUMI)、Zonula Occludens-1(ZO-1)免疫荧光及LUM mRNA RT?qPCR验证。构建全层角膜替代物：将5×104未分化或基质预分化hDPSCs混入mPRGF凝固为基质核心，先后用温度响应培养板(Nunc UpCell)收获超融合上皮/未分化细胞片及内皮/未分化细胞片自上而下、自下而上贴附，气液界面(Air-Liquid Interface, ALI)培养24 h完成三明治结构。检测指标包括：流变仪测存储模量(G′)与损耗模量(G″)、酶标仪380–730 nm透光率、WST法测细胞活力、培养1 d与5 d称重算质量损失、ELISA测条件培养基D?二聚体(D-dimer)与Ⅰ型前胶原(Procollagen Type I)、石蜡切片H&E与Ⅰ型胶原免疫组化。
【研究结果】
3.1 Human dental pulp stem Cell characterization
原代hDPSCs呈成纤维样形态，高表达CD73(99.8%)、CD90(99.7%)、CD105(99.5%)，造血/内皮标志物阴性；可成功向成骨（茜素红钙结节）、成脂（FABP4+）、成软骨（阿尔新蓝+蛋白聚糖）三系分化，符合间充质干细胞标准。
3.2 hDPSCs differentiation to corneal phenotypes
经诱导，hDPSCs分别获得扁平星形（基质）、立方形（上皮）、六边形（内皮）形态；上皮诱导后PanCKde novo表达，内皮诱导后ZO-1显著上调，基质诱导后LUM mRNA显著升高(p＜0.005)，证实hDPSCs可向三种角膜细胞表型定向分化。
3.3 Optical and rheological properties of the bioengineered grafts
两种移植物G′均大于G″（未分化组G′＝221.00±17.85 Pa，分化组G′＝299.91±126.41 Pa；p＞0.05），表现以弹性为主的力学行为，适于手术操作。含未分化hDPSCs移植物在可见光谱透过率显著高于含分化细胞组(p＜0.05～0.01)，透明度更优。
3.4 Viability of hDPSCs in the grafts
WST法示未分化hDPSCs组吸光度(2.32±0.32)约为分化组(1.03±0.20)两倍(p＝0.0040)，表明未分化hDPSCs在移植物中保持更高代谢活性与细胞密度。
3.5 Stability and remodel of the corneal grafts
培养5 d后未分化hDPSCs组质量损失达63.0%±13.9%（分化组11.7%±5.2%，p＝0.0146）；未分化组条件培养基D?二聚体累积释放(3892±401 μg vs 1618±572 μg, p＝0.0049@Day5)与Ⅰ型前胶原累积释放(2891±156 μg vs 664±79 μg, p＜0.0001@Day5)均显著更高，说明未分化hDPSCs加速纤维蛋白降解并促进新生胶原合成，基质重塑更活跃。
3.6 Histological analysis
H&E染色见未分化hDPSCs组细胞团侵入mPRGF基质明显；Ⅰ型胶原免疫组化显示未分化组mPRGF被广泛替换为新生Ⅰ型胶原基质，分化组仅浅表少量替换，印证重塑速率差异。
【讨论与结论翻译】
hDPSCs源自神经嵴，与角膜基质和内皮同源，天然组成性表达Lumican和ZO-1并在诱导后上调，且在适宜诱导下可获得PanCK+上皮表型，证明其角膜定向分化潜能。以PRGF纤维蛋白膜为生物活性支架、PRGF上清替代FBS构建无异种平台，含未分化hDPSCs的移植物具更佳透明度、更高细胞活力与弹性相当之力学行为。未分化hDPSCs因更强增殖与基质重塑能力，加速mPRGF降解并同步沉积Ⅰ型胶原，实现"临时支架渐进被自体细胞外基质取代"的动态仿生重塑，而预分化细胞此过程迟缓。PRGF－hDPSCs平台规避了合成材料无生物信号、胶原支架力学弱、脱细胞基质批间差大等问题，具备自体来源、非免疫原性、内置生长因子库及良好细胞相容性优势。
结论：由中央包埋hDPSCs的PRGF膜－纤维蛋白核心与模拟角膜三层细胞架构的前后细胞片组成的生物工程移植物，是一种有望用于未来临床角膜移植手术的动态仿生候选物。该平台亦可根据所包埋细胞分化状态调控重塑动力学，并可拓展至其他组织工程应用；后续需体内实验验证。
