《Frontiers in Toxicology》：Preventing regrettable substitutions: a proposal for a tiered testing approach for BPA alternatives under the PARC initiative
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双酚A（BPA）替代品在工业及消费品制造中的应用日益增加，这是继BPA受到法规限制之后的现象。然而，这些替代品的安全数据不足，引发了对潜在遗憾性替代的担忧。在欧盟化学品风险评估伙伴关系（PARC）框架下，第五工作包（WP5）通过采用基于OECD测试指南作为第一
双酚A（BPA）替代品在工业及消费品制造中的应用日益增加，这是继BPA受到法规限制之后的现象。然而，这些替代品的安全数据不足，引发了对潜在遗憾性替代的担忧。在欧盟化学品风险评估伙伴关系（PARC）框架下，第五工作包（WP5）通过采用基于OECD测试指南作为第一层、并扩展至包含新方法（NAMs）的、与人类相关的分层危害评估策略，来应对这一挑战。研究人员优先选择了八种BPA替代品，针对关键毒理学终点进行研究，即内分泌干扰（ED）、发育神经毒性（DNT）、免疫毒性、遗传毒性与致癌性以及代谢命运检测（解毒与潜在生物活化），以便早期识别生物活性并支持跨终点优先级排序。本手稿描述了该测试框架的结构与实施。该综合测试策略提出了一种结构化方法，用于识别潜在关注物质、指导靶向性的更高层级研究，并支持监管优先级排序。PARC WP5框架正在测试协调一致的基于NAM的方法是否有助于下一代风险评估，并帮助防止BPA替代品中的遗憾性替代，以实现快速监管采纳。详细的实验结果将在项目完成后另行报告。
**论文解读：PARC倡议下预防双酚A替代品遗憾性替代的分层测试方法**
**研究背景与问题**
双酚A（Bisphenol A, BPA）因其广泛的内分泌干扰（ED）等健康危害，在欧盟等地区受到日益严格的监管限制。这促使工业界加速开发和使用BPA的替代物质。然而，一个严峻的挑战随之而来：许多BPA替代品（如双酚S、双酚F等）的毒理学数据严重不足，导致存在“遗憾性替代”的风险——即用一种危害性相似或更大的物质取代另一种已被限制的危害物质。例如，尽管双酚S（BPS）已被较为深入研究，但其他众多替代品的安全性数据仍是空白。这种不确定性对公共健康和监管决策构成了重大挑战。因此，在欧盟化学品风险评估伙伴关系（PARC）的框架下，开展一项系统性研究，旨在制定并验证一套能够快速、可靠地评估BPA替代品潜在危害的测试策略，对于预防遗憾性替代、支持下一代风险评估（NGRA）和监管科学决策具有至关重要的意义。
**研究内容与意义**
本研究由PARC第五工作包（WP5）下设的一个项目承担，旨在填补八种优先选择的BPA替代品（BPZ、BPE、BPS-MAE、Pergafast 201、BPP、BPAP、TCBPA、TBBPA）的关键毒理学数据空白。研究人员开发并实施了一套基于人类健康相关的新型方法学（NAMs）的分层测试框架。该框架的核心是整合五类关键毒理学终点：内分泌干扰（ED）、发育神经毒性（DNT）、免疫毒性、遗传毒性与致癌性，以及代谢命运检测（解毒与潜在生物活化）。此举不仅针对BPA已知的健康效应，也遵循了相关监管机构的优先关注点。通过协调实验设计、集中采购物质和跨终点解读策略，该研究旨在为如何在大规模欧洲合作中实施NGRA原则提供概念验证。论文发表在《Frontiers in Toxicology》，其核心意义在于提出了一个可操作、可扩展的测试策略，以快速识别BPA替代品中的潜在风险信号，为监管优先排序提供科学依据，从而有效降低遗憾性替代的发生概率。
**主要关键技术方法**
本研究采用了一套分层、协调的测试策略，起始于符合OECD测试指南（TG）的体外测定，并逐步扩展至更复杂的体外/计算机模拟（in silico/ in vitro）方法。关键技术方法包括：
1. **标准化协调与集中采购**：所有测试化合物（八种BPA替代品及BPA作为参考化合物）由项目集中订购和分发，以确保批次一致性和实验室间可比性。物质选择过程与欧洲食品安全局（EFSA）和欧洲化学品管理局（ECHA）等监管机构专家共同设计。
2. **基于OECD TG的初级筛选**：应用已认证的OECD测试指南方法作为第一层筛选，包括用于评估内分泌干扰的类固醇生成测定（OECD TG 456）、用于遗传毒性评估的细菌回复突变试验（Ames试验，TG 471）和体外微核试验（MN试验，TG 487），以及用于检测致癌转化潜力的细胞转化试验（CTA，Bhas-42细胞，GD 231）。
3. **扩展的NAMs组合**：在初级筛选基础上，整合了多种机制性NAMs，例如：针对甲状腺激素转运（MCT8和NIS转运蛋白）的功能测定；基于人类神经祖细胞（hNPCs）的发育神经毒性体外测试组合（IVB）；针对免疫功能的原代外周血单核细胞（PBMCs）和人类细胞系（如THP-1、Jurkat T细胞）的功能与机制分析；以及利用人类肝脏模型（HepaRG、HepG2细胞）和亚细胞组分（微粒体、S9组分）研究代谢命运的I相和II相酶活性分析。
4. **高级模型与整合分析**：对于遗传毒性终点，第二层测试扩展至使用人类肝细胞癌细胞系HepG2的二维（2D）和三维（3D，球体）培养，结合彗星试验和MN试验，以增强组织相关性。所有毒理学数据将在一个筛选水平的证据权重框架内进行整合，以支持物质优先级排序，而代谢动力学数据则用于开发生理基础动力学（PBK）模型。
**研究结果**
**2.1 内分泌干扰**
- **类固醇生成（OECD TG 456）**：使用H295R人肾上腺皮质癌细胞系，在确定非细胞毒性浓度后，检测了BPA及八种替代品对睾酮和17β-雌二醇等激素水平的影响，以评估其干扰类固醇生成的能力。
- **甲状腺激素转运与碘摄取**：通过MDCK细胞过表达模型，评估了化合物对单羧酸转运蛋白8（MCT8）介导的三碘甲状腺原氨酸（T3）转运和钠/碘转运体（NIS）介导的碘摄取的影响。结果显示，多种化合物以不同效力干扰了这两种必需过程。在PCCl3大鼠甲状腺滤泡细胞系中，进一步分析了化合物对甲状腺特异性基因表达谱的影响，揭示了化合物特异的转录特征，且通常不伴随显著细胞活力丧失。这些数据证实了结合转运体NAM与甲状腺细胞分子终点对于优先排序BPA替代品的价值。
**2.2 发育神经毒性**
- 应用DNT体外测试组合（IVB），使用人类神经祖细胞（hNPCs）评估了化合物对增殖、神经元和少突胶质细胞分化、神经突生长和突触形成的影响。
- 为补充IVB的不足，研究人员开发并验证了一种新型测定，利用人类诱导多能干细胞（iPSC）衍生的海马神经元，评估化合物对海马神经元分化、成熟、突触可塑性标志物基因表达以及全局DNA甲基化的影响，旨在捕捉与学习和记忆相关的区域特异性神经发育效应。
**2.3 免疫毒性**
- **功能评估**：使用健康供体的原代外周血单核细胞（PBMCs）和人类细胞系，评估了BPA替代品对T细胞极化（Th1、Th2、Th17、Treg）和NK细胞裂解活性的影响，以及其对细胞因子（如IL-17A）和免疫球蛋白（IgG、IgM）产生的影响。
- **代谢与内分泌免疫串扰**：评估了化合物对炎症驱动的色氨酸（Trp）分解代谢（通过犬尿氨酸Kyn形成）的影响。通过计算机模拟筛选（Endocrine Disruptome平台）预测了化合物与多种核受体（包括雌激素受体、糖皮质激素受体GR等）的结合亲和力，并对最有效化合物进行了体外免疫调节测定，研究了其与糖皮质激素受体（GR）的相互作用及下游基因表达（如钙信号、qPCR）。
**2.4 遗传毒性与致癌性**
- **第一层测试**：综合应用Ames试验、体外微核试验（MN）在人类淋巴细胞中，以及Bhas-42细胞转化试验（CTA），以获取关于基因突变、染色体畸变和细胞恶性转化潜力的综合证据。
- **第二层测试**：在HepG2人类肝癌细胞系的2D培养和3D球体培养模型中，进行彗星试验和MN试验。结果表明，3D球体模型（一种NAMs）通过ReadEDTest框架评估获得了高就绪度评分（33.5/38），显示出良好的实验室可转移性和未来验证的潜力，并有助于在具备部分代谢能力的细胞系中表征DNA和染色体损伤效应。
**2.5 代谢命运检测**
- 开发了统一的操作程序（SOP）以确保物质溶解性和稳定性测试的标准化，并使用放射性标记分子进行支持。
- 利用人类肝脏模型（HepaRG、HepG2细胞）和亚细胞组分（肝脏、肾脏、肠道的微粒体/S9组分）以及单重组酶，表征了BPA替代品通过细胞色素P450（CYP）酶介导的I相氧化代谢路径，以及通过葡萄糖醛酸化和硫酸化（UGTs和SULTs）的II相结合与清除路径。
- 所有动力学参数将用于开发每个BPA替代品的生理基础动力学（PBK）模型，以支持体外数据向体内情景的外推。
**讨论与结论**
**讨论部分总结**：本项目通过整合多毒理学终点的数据，构建了一个筛选水平的证据权重框架。早期NAM测试作为筛选工具，识别出具有内分泌活性、神经发育扰动、免疫调节、遗传毒性或生物活化潜力的物质。在多个测定或终点中显示出一致生物活性的物质，将被优先考虑进行更高层级的靶向研究（如高级体外模型、TG+研究或精细化暴露评估）。代谢与动力学数据支持将体外发现转化为PARC框架内的PBK建模工作，从而改善对内暴露相关性的解读。这种跨终点整合策略确保了优先级排序决策由多个生物系统汇聚的机制信号所引导，而非单一测定的结果，从而支持监管评估流程，并最大限度地降低BPA替代品中发生遗憾性替代的可能性。
**研究结论翻译**：在这个使用NAMs组合的协调分层测试策略的背景下，WP5合作伙伴目前正在完成所呈现的测试。预期在2027年第一季度，将对生成的数据集进行整合分析并发表详细的实验结果。重要的是，该框架中包含的多个NAMs也正在接受可转移性和就绪度评估活动，以支持未来的验证和监管采纳。这种方法展示了此类努力如何在大型监管研究伙伴关系内，跨多个毒理学终点进行操作化。更具体地说，它有助于识别内分泌、神经发育、免疫、致癌和代谢终点中的机制预警信号，从而支持对BPA替代品进行进一步的靶向研究优先排序。重要的是，该项目产生的数据预计将提供筛选水平的机制证据，为建模工作、不良结局路径（AOP）开发和更高层级调查的设计提供信息，从而支持监管评估流程。通过结合协调的实验设计、跨终点整合和基于生理基础动力学（PBK）的解读，PARC WP5策略提出了一种可扩展的方法，以最大限度地减少在结构相关的化学替代品中发生遗憾性替代的可能性。
