环状RNA circNUP214作为microRNA-31海绵通过NFAT5促进重症肌无力进展

《Frontiers in Neurology》：Circular RNA circNUP214 serves as a microRNA-31 sponge to promote the progression of myasthenia gravis through NFAT5

　　

重症肌无力（MG）是一种由靶向神经肌肉接头的自身抗体驱动的自身免疫性疾病，导致肌肉无力。尽管新出现的证据表明环状RNA（circRNAs）参与MG，但其具体调控机制仍大多未知。特别是，circNUP214在MG中的作用尚未被表征。研究人员通过qRT-PCR检测了MG患者和健康对照者外周血单个核细胞（PBMCs）和CD4⁺ T细胞中circNUP214的表达。验证了其环状结构和细胞质定位。此外，确认了circNUP214与miR-31的相互作用，并评估了circNUP214对CD4⁺ T细胞增殖的调控效应。在31例纯AChR抗体阳性MG患者中，与健康对照（HC）相比，PBMCs中circNUP214表达显著升高。在CD4⁺ T细胞中也观察到circNUP214表达升高。功能上，circNUP214促进了CD4⁺ T细胞增殖，而其敲低则抑制了这一过程。机制上，circNUP214直接结合miR-31并通过海绵吸附miR-31上调NFAT5。在Jurkat细胞中的拯救实验进一步验证了circNUP214/miR-31/NFAT5 ceRNA调控轴。总之，circNUP214在31例纯AChR抗体阳性MG患者的PBMCs中高表达，并在CD4⁺ T细胞中也升高。它通过海绵吸附miR-31上调NFAT5表达，从而促进增殖。这些发现表明，circNUP214/miR-31/NFAT5轴可能参与MG中异常的CD4⁺ T细胞增殖。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
重症肌无力（myasthenia gravis, MG）是一种由靶向神经肌肉接头的自身抗体驱动的自身免疫性疾病，导致肌肉无力。尽管针对突触后蛋白的自身抗体是疾病病理的核心，但失调的T细胞反应在启动和维持自身免疫级联反应中起关键作用。特别是，CD4⁺ T细胞在MG患者中过度活化，其中Th17和滤泡辅助性T（Tfh）细胞通过促进B细胞分化为产生自身抗体的浆细胞，驱动致病性炎症。因此，CD4⁺ T细胞的异常激活和增殖被认为是MG发病的中心事件。环状RNA（circRNAs）是一类通过前体mRNA反向剪接产生的独特RNA分子，形成闭合环状结构，可作为竞争性内源RNA（ceRNA）吸附miRNA，解除对下游靶标的转录后抑制。新证据表明circRNAs在自身免疫性疾病中起关键调控作用，例如在系统性红斑狼疮（SLE）中，hsa_circ_0012919通过靶向miR-125a-3p调节CD4⁺ T细胞中MDA5的表达。同时，活化T细胞核因子5（NFAT5）作为免疫稳态的关键调节因子，在抑制促炎性T细胞反应中发挥重要作用，其T细胞特异性缺失可增强IFN-γ/IL-17产生并加剧自身免疫疾病。在MG中，已有研究发现多个circRNAs表达失调，但circRNAs导致CD4⁺ T细胞功能障碍的分子机制仍不清楚，尤其是circRNA介导的NFAT5调控在T细胞中的作用尚未阐明。因此，本研究旨在探索circNUP214在MG中的功能作用，并阐明其通过miR-31/NFAT5 ceRNA轴调控CD4⁺ T细胞增殖的机制。

**研究内容与意义**
研究人员从哈尔滨医科大学附属第二医院招募了40例MG患者和40例年龄、性别匹配的健康对照（HC），其中31例为纯AChR抗体阳性患者。通过qRT-PCR检测PBMCs和CD4⁺ T细胞中circNUP214表达，利用RNase R消化、核质分离验证其环状结构和定位；通过双荧光素酶报告实验验证circNUP214与miR-31的直接结合；结合生物信息学预测和拯救实验确认circNUP214/miR-31/NFAT5 ceRNA轴；并通过CCK-8和EdU实验评估细胞增殖。研究首次发现circNUP214在MG患者PBMCs和CD4⁺ T细胞中显著上调，其通过海绵吸附miR-31上调NFAT5，促进CD4⁺ T细胞增殖。该发现为理解circNUP214在MG发病中CD4⁺ T细胞激活中的作用提供了参考。论文发表在《Frontiers in Neurology》。

**主要关键技术方法**
1. **样本队列**：来自哈尔滨医科大学附属第二医院的40例MG患者和40例健康对照，其中31例为纯AChR抗体阳性患者。
2. **qRT-PCR**：检测PBMCs和CD4⁺ T细胞中circNUP214、NFAT5、miR-31的表达。
3. **RNase R消化与核质分离**：验证circNUP214的环状结构和细胞质定位。
4. **双荧光素酶报告实验**：在Jurkat细胞中验证circNUP214与miR-31的直接结合。
5. **细胞功能实验**：CCK-8和EdU实验评估Jurkat细胞增殖；Western blot检测NFAT5蛋白水平。

**研究结果**
**Characterization of circNUP214 function in Jurkat cells**
研究发现circNUP214（hsa_circ_0089153）是一种外显子环状RNA，定位于染色体9q34。通过RNase R消化实验证实其耐受消化，确认为环状结构；核质分离显示其主要定位于细胞质。在设计的三种siRNA中，S2敲低效率最高；过表达质粒显著升高其转录水平。

**CircNUP214 is upregulated and clinically correlated in MG patients**
在31例纯AChR抗体阳性MG患者中，PBMCs中circNUP214表达显著高于HC（p<0.001）。ROC曲线分析显示AUC为0.6835（95% CI 0.5599–0.8070，p<0.01），具有诊断价值。circNUP214表达与淋巴细胞计数呈正相关（r=0.4935，p<0.01），与中性粒细胞/淋巴细胞比值呈负相关（r=?0.3554，p<0.05）。在MGFA分型（眼肌型与全身型）和自身抗体亚型（单独AChR阳性与多抗体阳性）之间，circNUP214表达无显著差异。

**CircNUP214 is identified as a miR-31 target by in silico prediction and luciferase reporter assays in Jurkat T cells**
通过CircInteractome数据库预测miR-31与circNUP214的结合位点。双荧光素酶报告实验显示，与miR-NC相比，共转染野生型（WT）circNUP214报告基因与miR-31模拟物显著抑制萤火虫荧光素酶活性，而突变型（MUT）报告基因组的抑制减弱，证实circNUP214直接结合miR-31。

**CircNUP214 functions as a miR-31 sponge to regulate NFAT5 expression in MG patients**
结合starBase、miRTarBase、TargetScan和miRwalk预测miR-31靶基因，筛选出NFAT5等候选基因。MG患者PBMCs中NFAT5 mRNA显著升高（p<0.001），且与circNUP214表达呈正相关（r=0.4978，p<0.01）。在分选的CD4⁺ T细胞中，circNUP214和NFAT5在MG患者中均显著高于HC（p<0.01）。

**CircNUP214 regulates NFAT5 through miR-31 sponging in Jurkat cells**
敲低circNUP214降低NFAT5 mRNA和蛋白水平，过表达则升高；共转染miR-31抑制剂可逆转敲低导致的NFAT5下降，共转染miR-31模拟物可减轻过表达导致的NFAT5升高。CCK-8和EdU实验显示，敲低circNUP214抑制Jurkat细胞增殖，而共抑制miR-31可拯救该抑制；过表达circNUP214促进增殖，共转染miR-31模拟物则减弱该促进。

**讨论与结论**
讨论部分指出，MG是典型的抗体介导的自身免疫病，CD4⁺ T细胞异常激活和增殖是打破免疫耐受、启动自身免疫级联反应的中心事件。本研究首次报道circNUP214在MG患者PBMCs和CD4⁺ T细胞中上调，并验证了circNUP214/miR-31/NFAT5 ceRNA调控轴。与既往仅在类风湿关节炎中报道circNUP214促进Th17致病性不同，本研究揭示了其在MG中的新角色。NFAT5作为miR-31下游靶点，参与炎症反应和自身免疫疾病，如增强Th17分化、抑制Treg生成等。通过多途径，circNUP214/miR-31/NFAT5轴促成的CD4⁺ T细胞增殖可能加剧MG：过度活化的CD4⁺ T细胞（尤其是Tfh）提供B细胞帮助，促进抗AChR抗体亲和力成熟；NFAT5活性增强促炎因子（IFN-γ、IL-17、TNF-α）产生，破坏免疫稳态。研究局限性包括：功能实验在Jurkat细胞中进行，未使用原代CD4⁺ T细胞；未探讨circNUP214在Th1、Th17、Th2、Treg等亚群中的作用；样本量有限；未实验确认miR-31与NFAT5的直接结合。未来将利用原代CD4⁺ T细胞、流式分选或单细胞测序、体内动物模型及更大队列进一步验证。

**研究结论部分翻译**：总之，本研究揭示circNUP214在31例纯AChR抗体阳性MG患者的PBMCs中高表达，并在CD4⁺ T细胞中也升高。CircNUP214作为ceRNA，通过海绵吸附miR-31上调NFAT5，从而促进CD4⁺ T细胞增殖。本研究的发现可能为理解circNUP214在MG发病中CD4⁺ T细胞激活的作用提供有价值的参考。