人类MAPT突变体tau纤维中的Pick折叠

《Acta Neuropathologica》：The Pick fold in tau filaments from human MAPT mutants

　　

MAPT（tau基因）的突变导致与17号染色体相关的额颞叶痴呆和帕金森综合征（FTDP-17T），脑细胞中出现大量丝状tau包涵体。一些编码错义和缺失变体的突变可引发Pick病的临床表型，并在神经细胞中形成由三重复tau组成的纤维。研究人员在此报告了来自携带MAPT突变D252V、G272V、S320F和ΔG389-I392个体的脑组织中tau纤维的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构。具有D252V和ΔG389-I392突变个体的脑内存在双层Pick折叠，这些个体在胶质细胞中也出现大量tau包涵体。相比之下，G272V和S320F突变导致一种更开放的Pick折叠变体，其中残基272–341相对于结构其余部分旋转了20–25°。这些发现表明，纤维核心内的错义突变可以修饰Pick折叠，产生密切相关的结构变体。此外，研究人员通过使用携带12个丝氨酸或苏氨酸突变为天冬氨酸（PAD12）以及D252V、G272V和S320F错义突变的重组0N3R tau进行种子聚合，成功重建了Pick折叠及其部分变体。这项工作为发展基于结构的诊断和治疗方法奠定了基础。

**论文解读：人类MAPT突变体tau纤维中Pick折叠的结构变异**

**研究背景与问题**
MAPT基因编码tau蛋白，其突变可导致与17号染色体相关的额颞叶痴呆和帕金森综合征（FTDP-17T），表现为脑内大量tau纤维沉积。不同突变影响tau的mRNA剪接或微管结合能力，形成不同重复类型（3R、4R或3R+4R）的tau纤维，并产生特有的折叠结构。例如，某些错义突变如P301L、P301T、V337M、R406W等已发现与特定折叠相关。然而，对于Pick病中常见的3R tau纤维（Pick折叠），其在不同MAPT突变下的结构变异机制尚不清楚。此前仅在散发型Pick病和ΔK281突变中鉴定出Pick折叠，而其他突变（如D252V、G272V、S320F、ΔG389-I392）是否也形成相同折叠，以及错义突变如何影响核心构象，是亟待解决的问题。开展本研究旨在系统解析这些突变体tau纤维的冷冻电镜（cryo-EM）结构，阐明突变对Pick折叠的修饰作用，并探索体外重建可能性，为基于结构的诊断和治疗提供基础。

**主要技术方法**
研究人员从四例MAPT突变（D252V、G272V、S320F、ΔG389-I392）个体的死后脑组织中提取sarkosyl不溶性tau纤维，样本来源包括额叶皮层、颞叶皮层和尾状核（具体病例信息见原文）。主要方法包括：cryo-EM数据采集（Titan Krios电镜，Falcon4i或K3探测器）与三维重建（RELION软件），原子模型手动构建（Coot）与优化（Servalcat/ISOLDE和REFMAC5），免疫印迹（BR133/BR134抗体）和免疫组化（AT8、3R/4R tau抗体）鉴定纤维成分与包涵体分布，质谱分析（LC-MS/MS）确认突变肽段存在。体外种子聚合实验使用重组0N3R PAD12 tau（携带12个Ser/Thr→Asp替换）及其D252V、G272V、S320F、ΔG389-I392突变体，加入脑源性tau种子（每反应1 μL对应10 μg组织），在37°C振荡培养70小时，通过硫黄素T荧光监测聚合，并对产物进行cryo-EM结构解析。

**研究结果**

**Structures of tau filaments from the frontal cortex of individuals with the MAPT mutations encoding D252V and ΔG389-I392 tau**
通过cryo-EM解析D252V和ΔG389-I392额叶皮层tau纤维，分辨率分别达2.8 ?和2.3 ?。两种纤维均由单原丝组成，核心有序区从残基D/V252延伸到R379，与经典的Pick折叠（PDB:6GX5）结构一致，Cα原子均方根偏差（RMSD）分别为0.695 ?和0.389 ?。D252V突变纤维中，残基252处存在额外密度，提示V252侧链插入；ΔG389-I392缺失位于核心外，不影响结构。质谱分析显示两种突变体纤维中均同时存在野生型和突变型tau肽段，表明两者共组装。

**Structures of tau filaments from the temporal cortex of individuals with the MAPT mutation encoding G272V tau**
解析两例G272V突变个体颞叶皮层tau纤维，分辨率2.9 ?和2.0 ?。纤维为单原丝，核心从D252至R379，但呈现更开放的Pick折叠变体：茎区（β1-2, β7-β9）与长臂（β3-β6）分别与标准Pick折叠比较，RMSD为0.408 ?和0.476 ?，长臂相对茎区旋转约25°。V272侧链插入由V306、I308和V339形成的疏水口袋，导致局部构象改变（Q269和P270侧链内外翻转）。质谱检测到野生型G272和突变型V272肽段，提示共组装。纤维表面H268和K274附近存在额外密度，可能代表翻译后修饰或负电荷分子。

**Structures of tau filaments from the caudate nucleus of an individual with the MAPT mutation encoding S320F tau**
解析S320F突变个体尾状核tau纤维，分辨率2.8 ?。纤维为单原丝，同样呈现更开放的Pick折叠变体，长臂相对茎区旋转约20°，茎区和长臂的RMSD分别为0.603 ?和0.599 ?。F320侧链插入由V318、L325和I328形成的疏水口袋。与G272V类似，269QPGGG₂₇₃基序发生局部构象变化，但Q269和P270侧链未翻转。G272与V306、V339之间出现小分子非蛋白密度，可能模拟V272侧链稳定构象。质谱显示同时存在S320和F320肽段。

**Tau inclusions in the brains from individuals with MAPT mutations encoding D252V, G272V, S320F or ΔG389-I392 tau**
免疫组化（AT8）显示，D252V突变个体额叶皮层和海马中tau包涵体数量最多，ΔG389-I392次之，G272V和S320F较少。除Pick体（神经元内）外，D252V和ΔG389-I392病例还出现大量胶质细胞tau包涵体（分支状星形细胞和 coiled bodies），而G272V仅见少量少突胶质细胞包涵体、无星形细胞包涵体，S320F无胶质细胞包涵体。

**Seeded aggregation in vitro to assemble the Pick tau fold and variant filaments**
利用散发型Pick病脑源性种子聚合PAD12 tau，仅少数纤维形成Pick折叠双原丝，多数纤维易解旋。使用FTDP-17T突变种子时：
- PAD12-D252V tau种子聚合产生单原丝和双原丝，核心（255-363）采用Pick折叠，但364-379发夹结构部分无序；双原丝通过K340-K343与E342-E338的盐桥稳定。
- PAD12-G272V tau种子聚合也产生单原丝和双原丝，核心（256-358）结构与G272V脑源性纤维相似，但269QPGGG₂₇₃基序构象不同，V272与L344、F346形成新相互作用，Q269和P270侧链翻转。
- PAD12-S320F tau种子聚合产生四种结构：I型单/双原丝为经典Pick折叠（F320未诱导开放变体）；II型单/双原丝为全新折叠（核心V306-F378），不同于AD和CTE折叠，兼容3R和4R tau。
- PAD12-ΔG389-I392 tau种子聚合未产生Pick折叠，反而形成AD样配对螺旋纤维（PHF），可能因该病例脑内存在少量PHF种子。

**总结与讨论**
本研究证实D252V和ΔG389-I392突变纤维具有经典Pick折叠，而G272V和S320F突变导致Pick折叠的开放变体，长臂相对茎区分别旋转约25°和20°。这些变体保留大部分交叉β堆积作用，因此归类为Pick折叠的变体。所有脑源性纤维均为单原丝，且Pick体存在于神经元内，D252V和ΔG389-I392还伴有胶质细胞包涵体。突变导致3R tau纤维形成Pick折叠的机制尚不完全清楚，可能涉及野生型3R tau过表达或突变蛋白降低微管组装能力、暴露淀粉样生成基序（如306VQIVYK₃₁₁）。体外种子聚合实验部分重现了Pick折叠及其变体，但未能完全复制脑源性纤维的精确构象，提示核依赖性组装条件可能影响连接区域构象。这些cryo-EM结构为FTDP-17T提供了基于结构的分类（图8），并提示相同折叠可出现在不同临床背景中（如Alzheimer折叠见于AD和部分FTDP-17T）。本工作为发展Pick病基于结构的诊断和治疗方法奠定了基础。