用于测定天然水中有害蓝藻毒素含量的高效双模式液相色谱-串联质谱分析方法

《Journal of Chromatography A》：Efficient dual-mode liquid chromatography–tandem mass spectrometry methods for quantifying major cyanotoxins in natural water

　　丹妮·库里|克里斯特尔·帕莱兹|索菲·拉尔迪-丰坦|克里斯托夫·罗桑•实现了对四大类蓝藻毒素的高效分离。•在线固相萃取提升了对最非极性毒素的检测灵敏度。•亲水相互作用柱则能有效分离更极性的毒素。•这些方法在多种地表水和饮用水中的检测表现优异。•2025年夏季，对法国大东部地区的样本检测发现了11种蓝藻毒素。

引言
蓝细菌，又称蓝绿藻，是地球上最古老的产氧光自养生物之一，其进化历史可追溯至约35亿年前[74,76]。它们广泛存在于淡水、河口及海洋环境中[72]，由于某些蓝细菌能够固定大气中的氮元素，因此在水生生态系统中起着重要作用，同时也有助于食物网中的养分循环[11]。经过漫长的进化适应，蓝细菌能够在各种地球化学和气候条件下生存，包括由人类活动引起的富营养化、水资源调配以及海水入侵等问题。尽管蓝细菌具有重要的生态价值，但在营养物质浓度高、温度适宜且水体层结构稳定的条件下，它们会大量繁殖，形成水华。这类水华会对环境和公众健康造成严重威胁[47]。蓝藻水华的外观与绿藻相似，常常会导致饮用水出现异味，还会造成水体缺氧，并破坏水生生物的多样性（Chorus和Welker，2021）。不过，与绿藻不同，某些蓝细菌在光照、养分充足、温度适宜以及盐度变化等有利条件下，能够合成有毒的次级代谢产物——蓝藻毒素[50,66,69,85]。气候变化可能会加剧这类现象，因为温度上升、降水模式改变、径流增加以及水体分层加剧都可能延长水华持续时间并提高毒素产量。此外，蓝藻毒素的合成还受到多种环境因素的复杂影响，如养分含量（尤其是氮和磷）、氧化应激以及微生物群落的动态变化，这使得在气候变化背景下管理水华愈发困难[88]；Khiari等人，2019年；[87]；Huisman等人，2018年。这些毒素主要在完整的蓝细菌细胞内合成并储存，通常在细胞衰老、死亡或裂解时才会释放到水中。不过，某些蓝细菌物种还能主动将特定的毒素，尤其是阿诺毒素和圆柱孢藻毒素，直接释放到水中，而无需细胞裂解，从而实现细胞外释放[40]；Amzil等人，2022年；[17]。蓝藻毒素结构多样，具有不同的物理化学性质和毒性，可引发人类、野生动物及宠物的皮肤刺激、胃肠道疾病、肝损伤以及神经毒性[2]。

蓝细菌次级代谢产物的化学多样性仍在不断拓展。最初的CyanoMetDB数据库包含了2100多种蓝细菌代谢产物及其结构相关的化合物，此后在2023年又新增了499种，2024年的最新版本则新增了480种，目前总共有3000多种记录[42,44,65]。该数据库涵盖了多种代谢产物类别，包括微囊藻毒素、结节藻素、石房蛤毒素、阿诺毒素和圆柱孢藻毒素等著名的蓝藻毒素，还有众多蓝藻肽以及其他生物活性次级代谢产物，如蓝藻肽醇、脱肽、鱼腥藻肽、微囊藻素、铜绿微囊藻素、隐藻素、环酰胺等等。在已知的毒素家族中不断有新变种被发现，同时也有更多未被充分研究的化合物被识别出来，这体现了蓝细菌代谢产物多样性的动态性和复杂性。在如此广泛的化学物质体系中，世界卫生组织针对不同类型的水体制定了这些蓝藻毒素的参考值，这些数值反映了不同水体中暴露途径和健康风险的差异。现有的急性毒性数据进一步表明，这些蓝藻毒素家族的毒性范围很广。根据在小鼠体内测得的腹腔注射LD50值，石房蛤毒素和阿诺毒素属于毒性最强的蓝藻毒素，其LD50值通常在10到50微克/千克体重之间。阿诺毒素/高阿诺毒素和微囊藻素的LD50值一般在50到600微克/千克体重之间，而在实验条件下，圆柱孢藻毒素的急性毒性相对较低，其LD50值约为2毫克/千克体重。不过，从健康风险的角度来看，圆柱孢藻毒素仍然具有很高的危害性，因为它具有细胞毒性、肝毒性、肾毒性以及基因毒性。在微囊藻素家族中，不同同系物的毒性也存在很大差异：在常规监测中常见的甲基化变种的LD50值通常在40到260微克/千克体重之间，而较少被监测的去甲基化变种也可能出现在某些蓝藻属中，它们的毒性也与此范围相近。这种毒理特性的多样性表明，有必要监测多种蓝藻毒素家族以及每个家族中的多个变种，而不能仅依赖某种单一的标志物或总体毒素检测结果[48]。

对于微囊藻素这类由微囊藻、鱼腥藻和长孢藻等属产生的具有肝毒性的环状七肽，世界卫生组织制定了相应的饮用水参考值：终生暴露的限值为1微克/升，短期（不超过2周）暴露的限值为12微克/升，而对于配方奶喂养的婴儿，则建议采用更严格的3微克/升的限值。世界卫生组织针对娱乐用水设定的微囊藻素参考值为24微克/升[79]。圆柱孢藻毒素是一种具有细胞毒性的生物碱，会对肝脏、肾脏和红细胞造成损害，世界卫生组织建议终生饮用水中的浓度限值为0.7微克/升，短期暴露的限值为3微克/升，婴儿的预防性限值与终生暴露限值相同；娱乐用水的参考值为6微克/升[80]。目前关于阿诺毒素及其类似物的毒理学数据还不足以制定正式的饮用水参考值，但暂时建议短期暴露的限值为30微克/升，同时建议避免让婴儿和儿童接触含阿诺毒素浓度超过6微克/升的水。在娱乐用水方面，世界卫生组织提出的基于健康风险的参考值为60微克/升[81]。石房蛤毒素是一类神经毒性的麻痹性贝类毒素，既可由淡水蓝细菌产生，也可由海洋甲藻产生，世界卫生组织为其制定的饮用水参考值为3微克/升，这一数值是基于最敏感的配方奶喂养婴儿群体得出的，适用于急性暴露情况；相应的娱乐用水参考值为30微克/升[82]。结节藻素是一类结构类似的肝毒性肽类，主要由咸水中的结节藻产生，目前世界卫生组织尚未为这类物质设定饮用水或娱乐用水的参考值。在法国，国家健康安全局也为供人类饮用的水以及娱乐用水中各类已检测到的蓝藻毒素制定了最高允许浓度标准，分别为微囊藻素0.2和0.3微克/升，圆柱孢藻素1和42微克/升，石房蛤毒素0.8和30微克/升。对于阿诺毒素，国家健康安全局提出了低于检测限的标准（监测工作主要依靠酶联免疫吸附试验或其他免疫测定方法，这些方法是初步筛查的工具[1,26]）。虽然这些方法能够快速进行综合检测，但通常无法区分同一毒素家族中的不同变种，例如，基于Adda蛋白的微囊藻素检测方法只能给出微囊藻素和结节藻素的总体检测结果，无法区分微囊藻素-LR、微囊藻素-RR、微囊藻素-YR以及其他微囊藻素同系物。此外，由于交叉反应，ELISA检测结果可能会出现偏高，而且每次检测通常只能针对一种毒素家族或目标群体，因此无法在一次分析中同时检测多种蓝藻毒素家族[28,53,54,58]。尽管近年来这些商业检测试剂盒的选择性有所提升，但由于微囊藻素的降解，以及其他蓝藻毒素如结节藻素中也存在Adda结构单元，检测结果仍常常偏高，从而导致假阳性现象[30,35,56,64]。因此，正如监测指南所建议的，阳性ELISA检测结果应通过液相色谱-串联质谱法等仪器分析方法进行确认。此外，ELISA检测结果和LC-MS/MS检测结果往往存在差异，尤其是在MS/MS分析中只针对少量毒素变种时。例如，ELISA检测可能检测出的是总毒素含量，而针对性的LC-MS/MS检测则只能识别和定量预先设定的毒素类似物，而这些类似物可能仅代表样品中实际存在的毒素的一小部分。因此，如果毒素谱型的特征描述不完整，就可能会影响风险评估，进而限制水资源管理者优化处理流程或发布公共卫生预警的能力。鉴于此，就有必要开发出能够高精度地检测多种蓝藻毒素、具有较低的检测和定量限，且能在不同类型的水样中保持稳定检测性能的分析方法。

反相液相色谱技术的进步使得能够在水和生物样本中同时检测阿诺毒素、圆柱孢藻毒素、微囊藻素和结节藻素[29,40,59,89]。然而，由于各类蓝藻毒素的物理化学性质、电荷状态和结构特征差异极大，要使用单个反相液相色谱柱将所有主要的蓝藻毒素完全分离仍然是一项挑战。尤其是那些高极性的分析物，往往需要使用离子对试剂或衍生化技术来增强其在色谱柱上的保留时间，但这些添加剂会增加背景噪音，最终降低定量限，从而影响检测性能[19]。为了解决这些问题，人们采用了亲水相互作用液相色谱技术，该技术能够有效保留和分离阿诺毒素、圆柱孢藻毒素以及石房蛤毒素这类高极性的蓝藻毒素（Mar [6,8,19,32,46]）。亲水相互作用液相色谱技术兼具正交选择性以及水相和有机相流动相的兼容性，因此可以将多种毒素类别整合到统一的分析流程中。

基于以上背景，本研究的核心目标是开发出快速、可靠且高效的分析方法，用于检测地表水和饮用水中的11种微囊藻素、1种结节藻素、3种阿诺毒素、3种圆柱孢藻毒素以及6种石房蛤毒素（所有目标化合物的结构见图1）。这些化合物都属于需要重点监管和研究的蓝藻毒素类别。为了应对这些分析物极高的极性差异，本研究采用了双模式分析流程：肽类物质（微囊藻素和结节藻素）通过在线固相萃取结合高效液相色谱-串联质谱法进行分析，而高极性毒素（阿诺毒素、圆柱孢藻毒素、石房蛤毒素）则通过直接进样结合亲水相互作用液相色谱-串联质谱法进行分析。这些方法是根据SANTE/EURL的指导原则进行优化和验证的，同时还通过参与实验室间能力比对测试，进一步确保了方法的可靠性及其与国际标准的一致性。2025年夏季，法国大东部地区发生蓝藻水华后，通过对采集的5份水样进行分析，证明了这些方法的适用性。

片段选录
天然标准品和同位素标记标准品的选取
目标分析物的选取是基于一种结构优先级框架，该框架综合考虑了各主要蓝藻毒素家族的毒理学重要性、在环境中的存在情况以及结构多样性特征[18,86]。除了这些科学标准之外，选取过程还考虑了一个重要的知识空白问题。在法国，某些蓝藻毒素的环境数据可能十分稀缺、不完整或根本不存在，这就引发了这样一个问题：这些毒素是否真的……

MS/MS条件的优化
方法开发的第一步是将各种蓝藻毒素标准品直接注入Qtrap 5500质谱仪，以确定多反应监测模式下最合适的母离子和对离子对。每种毒素标准品（各种微囊藻素变种、石房蛤毒素、阿诺毒素及其类似物以及结节藻素）都是在酸化的乙腈和水（体积比50:50）溶液中，加入5毫摩尔/升的甲酸铵后配制的，然后以10微克/升的浓度、恒定的流速（10微升/分钟）直接注入质谱仪。针对每种化合物，质谱参数会自动确定……

这些方法在环境监测中的应用
在2025年夏季水华季节，这些方法还在实际的野外环境中得到了应用，以此评估它们在环境监测中的适用性。表3显示了2025年夏季在法国大东部地区采集的6份天然地表水样本中检测出的蓝藻毒素浓度（单位为纳克/升）。在所检测的24种蓝藻毒素中，有11种在至少一份地表水样本中被检测到，其中微囊藻素，尤其是微囊藻素-RR、微囊藻素-RR、微囊藻素-YR和微囊藻素-WR，是出现频率最高的毒素。

结论
本研究介绍了两种简单且可靠的HPLC-MS/MS分析方法的开发与验证工作，这两种方法专门用于检测地表水和饮用水中的主要蓝藻毒素家族。这些方法巧妙地将在线固相萃取与反相HPLC-MS/MS技术相结合，用于检测非极性的微囊藻素和结节藻素，同时还将直接进样HPLC-MS/MS技术（亲水相互作用液相色谱模式）用于检测高极性的阿诺毒素……

资金支持
这项研究得到了法国卫生部以及大东部地区卫生局的资助，这些资助属于该地区水质监测计划的一部分。作者们没有需要披露的任何财务或非财务利益关系。

作者贡献说明
丹妮·库里：方法学研究、方法验证、正式数据分析、实验研究、结果可视化、初稿撰写、文章审阅与修改。克里斯特尔·帕莱兹：方法验证、研究监督、文章审阅与修改。索菲·拉尔迪-丰坦：研究构思、研究监督、文章审阅与修改。克里斯托夫·罗桑：概念设计、项目管理、监督、验证、写作——审阅与编辑。利益冲突声明作者声明没有已知的可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。数据提供方式数据可应对应作者的要求提供。伦理审批无需批准。参与同意书无需批准。发表同意书为便于开放获取，作者已对由此提交的任何被接收的手稿版本应用CC BY公共版权许可。未引用参考文献[5,15,41,45,67,83,84]CRediT作者贡献说明丹尼·库里：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、软件使用、资源整理、方法论、研究实施、数据整理、验证。克里斯特尔·帕莱兹：写作——审阅与编辑、验证、监督。索菲·拉尔迪-丰坦：写作——审阅与编辑、监督、概念设计、验证。克里斯托夫·罗桑：写作——审阅与编辑、验证、监督、项目管理、概念设计。利益冲突声明作者声明没有已知的可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。致谢作者感谢大东部地区ARS机构人员在监测项目实施中的支持与协作。同时衷心感谢食品安全实验室（LSAL，梅松阿尔福）在方法开发过程中提供的宝贵技术交流与帮助，特别感谢文森特·霍尔特和罗内尔·比雷。这项工作是在南锡水文实验室的ANSES工作人员的共同努力下完成的。