基于生物测定的方法从茉莉酸甲酯诱导的印度樟愈伤组织中筛选出抗糖尿病植物化学物质：一种多靶点治疗策略

《Journal of the Indian Chemical Society》：Bioassay-guided discovery of antidiabetic phytochemicals from methyl jasmonate elicited callus of Dodonaea viscosa (L.) Jacq.: A multitarget therapeutic approach

　　乔蒂·卡纳曼尼·巴拉蒂|克里希纳莫尔蒂·阿卡什|斯里尼瓦桑·拉梅什库马尔|拉马斯瓦米·阿南丹|穆图·阿尔朱纳·萨米·普拉卡什•甲氧基茉莉酸处理可提高D. viscosa愈伤组织培养物中的生物量及代谢产物生成量•该处理所得提取物具有较强的抗氧化作用及酶抑制活性•其中的生物活性成分可通过上调GLUT4、AMPK、脂联素和PDX-1来改善葡萄糖摄取与胰岛素分泌功能•通过LC-MS和GC-MS分析，发现了一些具有强结合亲和力的黄酮类化合物，进一步证实了D. viscosa作为高效多靶点抗糖尿病物质的潜力。

引言
21世纪，糖尿病，尤其是2型糖尿病，已成为全球发展最快的健康危机之一。根据国际糖尿病联合会《糖尿病地图集》（第11版）的数据，预计有5.89亿年龄在20至79岁之间的成年人患有糖尿病，占全球成年人口的11.1%。到2050年，这一数字可能上升至8.53亿，占比达到13%。更为令人担忧的是，还有近2.52亿人尚未被诊断出患病，而他们大多生活在医疗和诊断服务难以普及的低收入和中等收入国家[1]。糖尿病还会显著增加严重健康并发症的风险。糖尿病的管理主要侧重于维持正常的血糖水平以及预防或延缓并发症的发生。目前，美国食品药品监督管理局已批准约60种抗糖尿病药物，另有100种处于临床测试阶段。诸如二甲双胍、磺脲类药物、噻唑烷二酮类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、DPP-4抑制剂、GLP-1受体激动剂以及SGLT2抑制剂等疗法已被用于糖尿病的治疗。在疾病较为严重的阶段，则需要使用胰岛素疗法[2]。尽管治疗手段已有很大改进，但全球糖尿病病例的持续增加凸显出迫切需要采取预防策略、实现早期诊断以及确保所有人都能获得医疗服务。自古以来，药用植物就被广泛使用，被视为现代医学的基础[3]。不同文化中，这些植物的治疗功效已有数千年的应用历史，传统知识代代相传，充分体现了它们在民族药学中的重要地位[4]、[5]。在印度，药用植物早已成为医疗体系的一部分，古代文献中也记载了它们的治疗作用[6]。非洲和亚洲等其他地区也有类似的传统，长期利用草药治疗各种疾病[7]。时至今日，全球仍有近80%的人口依赖植物疗法，因为这些疗法易于获取、价格低廉且副作用较少[8]。民族植物学研究对于传承这些传统知识以及发现具有药理特性的新植物至关重要[9]、[10]。化学、药理学、民族植物学和生物技术之间的跨学科合作，有助于更深入地了解植物衍生化合物与人体生物系统之间的相互作用[11]、[12]。这种跨学科方法有助于新生物活性分子的发现及其作用机制的阐明。植物生物技术的发展以及分析化学的进步，提升了草药提取物的标准化水平，而网络药理学则为研究植物代谢物与分子靶标之间的复杂相互作用提供了新的思路[11]、[13]。在全球范围内，中国、印度和巴西在民族药理学研究以及传统药用植物的创新方面处于领先地位[14]、[15]。印度的阿育吠陀体系至今仍在全世界广为流传。中国在草药研究以及传统药理学与现代药理学的融合方面，显示出比其他国家更强的本土医疗体系的科学潜力[16]、[17]。已有超过100种植物，尤其是豆科、百合科和唇形科的植物，被证实具有抗糖尿病作用，其作用机制包括抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶、增强胰岛素敏感性以及调节氧化应激[18]、[19]。这些治疗作用主要与黄酮类、生物碱、萜类和酚类等生物活性分子有关[20]。尽管取得了这些进展，但要分离和鉴定出活性植物化学物质仍非易事。由于植物提取物会受到环境条件变化的影响，且缺乏标准的活性化合物提取流程，往往难以准确识别出活性成分[21]。此外，某些研究不足的地区缺乏临床验证，相关植物化学研究的报道也不够充分，这些都制约了这些研究成果的转化应用[22]。

Dodonaea viscosa（L.）Jacq.是无患子科的一种开花植物，广泛分布于热带、亚热带和温暖温带地区[23]。在印度尼西亚，该物种有两个亚种，分别是生长在高原地区的D. viscosa subsp. angustifolia和通常生长在沿海地区的D. viscosa subsp. viscosa[24]。在民族植物学应用中，它还被用作抗菌、镇痛、抗病毒、舒缓情绪、治疗溃疡以及预防癌症的物质[25]。历史上，不同文化都因其药用价值而重视D. viscosa。在秘鲁，它被用作民间药物来治疗风湿病和骨痛；在夏威夷，则被用来治疗皮疹和皮肤疾病[26]、[27]。植物化学研究发现了多种生物活性化合物，如异鼠李素、山柰酚、槲皮素、甲基多朵维酸B、哈德威基酸、粘液质和多朵酸，这些成分正是其发挥药理作用的关键[28]。先前的研究显示，D. viscosa提取物具有很强的抗氧化活性[29]。甲醇和氯仿提取的叶提取物被证明能有效降低四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的血糖水平，并改善SGPT、SGOT、甘油三酯和胆固醇等生化指标[30]。D. viscosa中的异戊二烯化黄烷醇还能促进3T3-L1细胞中脂肪细胞的分化以及aP2和GLUT4基因的表达，这表明它们参与了葡萄糖代谢过程[31]。该植物还具有很强的抗炎和镇痛作用。内布罗登辛A和乙醇-水提取物能够减轻大鼠足部水肿的炎症反应[32]、[33]。此外，D. viscosa还对细菌和真菌具有强大的抗菌作用[34]，并且已被证明对多种癌细胞具有细胞毒性和抗癌作用。乙醇水提取物可通过改变线粒体膜电位以及提高凋亡蛋白如caspase-3和p53的水平，导致结直肠癌细胞发生凋亡[28]。乙醇叶提取物也能抑制结肠癌细胞的增殖[26]，而从花朵中分离出的化合物则对炎症性乳腺癌细胞具有剂量依赖性的抗增殖作用[27]。目前还没有针对D. viscosa的体外愈伤组织或诱导系统的直接研究，但类似的研究表明，通过优化生长调节剂，可以提高次级代谢产物的生成量[35]。尽管有大量的药理学证据，但关于D. viscosa的民族植物学及抗糖尿病研究却相对较少。这一现状存在较大的研究空白，因为目前对于D. viscosa愈伤组织在体外产生的具体次级代谢产物、其在糖尿病相关检测中的效力以及其作用机制仍知之甚少。

植物组织培养技术，尤其是愈伤组织培养技术，为生产有价值的次级代谢产物提供了一种可持续且可控的方法。与野外生长的植物不同，愈伤组织培养不受季节、地域和环境变化的影响，而且可以通过诱导策略来调控特定生物活性化合物的生物合成。因此，基于愈伤组织的方法在发现和生产具有药用潜力的植物化学物质方面越来越受到重视。目前针对D. viscosa的抗糖尿病研究主要使用的是粗提的植物提取物，尤其是来自叶子的提取物。不过，这些研究使用的是天然粗提物，而非体外培养系统。在体外愈伤组织培养条件下，尤其是施加了诱导剂的情况下，抗糖尿病代谢产物的产量有望得到提升。然而，无论是否经过诱导，D. viscosa愈伤组织的植物化学多样性及其降糖效果仍需进一步研究。本研究的目的是确定体外提取的D. viscosa叶提取物及诱导形成的愈伤组织提取物所具有的抗糖尿病作用，进而对其中具有生物活性的成分进行分离和鉴定。同时，还比较了这些成分在细胞模型中调节胰岛素分泌、葡萄糖摄取以及与糖尿病相关的代谢蛋白表达的能力。本研究采用了以生物测定为导向的分离技术，再通过GC-MS和LC-MS对这些生物活性成分进行进一步鉴定，同时通过计算模拟方法分析它们与主要糖尿病靶蛋白的相互作用，以此寻找可用于后续药物开发的潜在先导化合物。本研究通过多种体外和细胞实验，阐明了D. viscosa中生物活性成分的抗糖尿病功效，并筛选出了潜在的先导化合物。

部分内容节选
植物材料的采集与记录
研究中的D. viscosa植株采自印度泰米尔纳德邦纳马卡尔县的纳马吉里佩塔伊（纬度11.4562899°N，经度78.2685402°E，海拔261米）。印度泰米尔纳德邦奇丹巴兰安纳马莱大学理学院植物学系的L. Mullainathan教授对该植物材料的真实性进行了核实，其登录编号为599（见图S1）。
外植体的制备与培养条件
D. viscosa通过根茎切段进行无性繁殖。这些根茎在分子生物学实验园中进行培养。
愈伤组织的形成与诱导
将叶片外植体接种到添加了不同浓度和比例的生长素与细胞分裂素的MS培养基中。经过8天的培养后，便可见到愈伤组织的形成（见图1a-g），且愈伤组织形成的程度会随着培养基中2,4-D、BAP和TDZ浓度的不同而有所差异（见表1）。在所有测试过的植物生长调节剂中，T16组合（1.0毫克/升的2,4-D加上0.5毫克/升的TDZ）能促使PGFC愈伤组织以最高的速率形成，形成率为78.67±1.33%。相比之下，其他组合的形成率则较低。

结论
在本研究中，我们成功优化了D. viscosa的体外培养及诱导系统，这充分展现了该植物作为多功能抗糖尿病化合物来源的巨大潜力。甲氧基茉莉酸处理后的愈伤组织提取物在积累生物活性植物化学物质方面表现最为出色，不仅具有很强的抗氧化作用，还能抑制与糖尿病相关的关键酶的活性。其中的MF4生物活性组分还能进一步促进葡萄糖的摄取……

作者贡献说明
乔蒂·卡纳曼尼·巴拉蒂：撰写——初稿、方法学、研究实施、正式分析、概念设计。克里希纳莫尔蒂·阿卡什：软件操作、正式分析、数据整理。穆图·阿尔朱纳·萨米·普拉卡什：撰写——审阅与编辑、结果验证、研究指导。斯里尼瓦桑·拉梅什库马尔：撰写——审阅与编辑。拉马斯瓦米·阿南丹：撰写——审阅与编辑

未引用参考文献
[36]、[46]、[47]、[49]、[50]、[51]、[52]、[53]、[54]、[55]、[62]、[73]、[75]、[84]、[95]、[120]、[139]、[140]、[167]、[168]、[169]、[170]、[172]

利益冲突声明
作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

数据可用性
本研究的所有数据均包含在论文中。

资金支持
本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织提供的任何资助。

利益冲突声明
? 作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。