《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Olfml3 Regulates Microglial Inflammation and Neuronal Injury in Obstructive Sleep Apnea via Cybb-Mediated TLR4/NF-κB Pathway
编辑推荐：
背景：阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）中的神经认知功能障碍主要由间歇性低氧（IH）触发的神经炎症驱动，小胶质细胞在其中发挥关键作用。Olfml3在IH诱导的神经炎症中的作用尚不清楚。方法：研究人员分析了IH诱导的OSA小鼠海马的单细胞RNA测序（scRNA-seq
背景：阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）中的神经认知功能障碍主要由间歇性低氧（IH）触发的神经炎症驱动，小胶质细胞在其中发挥关键作用。Olfml3在IH诱导的神经炎症中的作用尚不清楚。方法：研究人员分析了IH诱导的OSA小鼠海马的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，以识别细胞亚群，并进一步关注Olfml3在小胶质细胞中的差异表达、富集通路和分化轨迹。使用IH处理的小胶质细胞建立了体外OSA模型。采用qRT-PCR和蛋白质印迹法（WB）评估Olfml3和细胞色素b（Cybb）的表达。通过流式细胞术评估小胶质细胞极化，使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量炎症细胞因子。使用荧光探针检测活性氧（ROS），通过WB检测Toll样受体4（TLR4）、磷酸化p65（p-p65）和p65的表达来验证TLR4/NF-κB通路激活。通过用小胶质细胞条件培养基处理神经元，随后进行CCK-8活性评估和流式细胞术凋亡分析来评估神经元损伤。通过将小鼠暴露于IH处理构建了体内OSA模型。使用Morris水迷宫和血氧饱和度测量评估小鼠的认知缺陷，通过HE和TUNEL染色检查脑组织病理变化和细胞凋亡。采用免疫组织化学染色检测Olfml3和Cybb蛋白水平。进行免疫荧光测定以测量Iba1来评估小胶质细胞激活。使用荧光探针检测ROS水平。通过WB评估TLR4/NF-κB通路蛋白的表达。通过流式细胞术分析CD86/CD206比值，通过ELISA分析炎症细胞因子的表达。结果：scRNA-seq揭示了低氧条件下小胶质细胞比例降低，进一步分析发现小胶质细胞中的Olfml3与Cybb呈负相关。IH诱导的OSA模型证实，Olfml3过表达通过Cybb抑制TLR4/NF-κB通路，从而减轻小胶质细胞炎症和神经元损伤。体内实验进一步验证了Olfml3在OSA中对IH诱导的神经炎症的保护作用。结论：小胶质细胞中的Olfml3通过Cybb/TLR4/NF-κB轴减轻IH诱导的促炎激活和神经元损伤，从而对OSA相关的神经炎症提供神经保护。
**论文解读：Olfml3在阻塞性睡眠呼吸暂停中小胶质细胞炎症与神经元损伤中的调控作用**
**研究背景与问题**
阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）是最常见的睡眠相关呼吸障碍，其核心病理特征是睡眠期间反复上气道塌陷导致间歇性低氧（IH）。IH触发中枢神经系统（CNS）的神经炎症和神经元凋亡，进而引起行为和功能缺陷。小胶质细胞作为CNS驻留免疫细胞，在OSA患者神经炎症的启动和维持中起关键作用，其在IH环境下向促炎（M1）表型极化，释放促炎因子，加重神经功能障碍。然而，小胶质细胞炎症调控的分子机制尚不完全明确。Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）通路的激活与小胶质细胞炎症密切相关，但OSA中该通路激活的具体机制仍不清楚。Olfml3是一种属于嗅质蛋白结构域家族的糖蛋白，在脑内高表达，参与神经发育和免疫调节，但其在OSA相关神经并发症中的作用尚未被探索。因此，研究人员旨在阐明Olfml3在OSA病理条件下对小胶质细胞炎症和神经元损伤的调控作用，为OSA相关神经炎症的治疗靶点提供理论基础。
**研究内容与结论**
研究人员通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析OSA小鼠海马细胞图谱，发现缺氧条件下小胶质细胞比例降低，且Olfml3在小胶质细胞中表达下调，与细胞色素b（Cybb）呈负相关。体外IH诱导的OSA模型证实，Olfml3过表达通过抑制Cybb介导的TLR4/NF-κB通路，减轻了小胶质细胞炎症和神经元损伤。体内实验进一步验证了Olfml3对IH诱导的OSA神经炎症的保护作用，表现为改善认知功能、降低脑组织ROS水平、抑制TLR4/NF-κB通路激活，并促进小胶质细胞向抗炎（M2）表型极化。该研究首次揭示了Olfml3通过Cybb/TLR4/NF-κB轴发挥神经保护作用，为OSA相关神经炎症提供了新的治疗方向。论文发表在《CNS Neuroscience》。
**主要关键技术方法**
研究人员从SRA数据库（PRJNA1089719）获取scRNA-seq数据，使用Seurat包进行降维聚类和细胞注释，Monocle 2进行伪时间轨迹分析。体外实验使用IH处理的BV2小胶质细胞系建立OSA模型，通过质粒转染实现Olfml3和Cybb的过表达或敲低。体内实验采用C57BL/6小鼠构建IH诱导的OSA模型，通过脑立体定位注射慢病毒进行基因修饰。关键检测方法包括：qRT-PCR和WB检测mRNA和蛋白表达；流式细胞术分析小胶质细胞M1/M2极化（CD86/CD206）和神经元凋亡；ELISA定量炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β）；荧光探针检测ROS水平；Morris水迷宫评估认知功能；HE和TUNEL染色观察病理和凋亡；IHC和IF检测蛋白定位和表达。样本来源为小鼠海马组织。
**研究结果**
**3.1 Olfml3在OSA中低表达并抑制小胶质细胞激活**
通过scRNA-seq分析，研究人员在缺氧条件下识别出29个细胞簇，其中小胶质细胞分为4个亚群，Olfml3在簇0、1、2中高表达，在簇3中低表达。GO和KEGG富集分析显示，低表达Olfml3的簇3富集于单核细胞增殖、白细胞增殖、内皮细胞迁移、IL-6产生及小胶质细胞发育和激活等炎症相关通路。体内验证显示，OSA小鼠脑组织中Olfml3 mRNA和蛋白水平显著降低，小胶质细胞激活标志物Iba1表达增加。体外IH诱导的BV2细胞中Olfml3表达也显著下降。
**3.2 Olfml3过表达减轻小胶质细胞炎症并抑制神经元损伤**
通过构建Olfml3过表达的BV2细胞，流式细胞术显示Olfml3过表达显著降低IH诱导的CD86
+/CD206
+比值（M1/M2比例），ELISA表明促炎因子TNF-α和IL-1β减少，抗炎因子IL-10和TGF-β增加。用Olfml3过表达小胶质细胞的条件培养基处理HT22神经元后，CCK-8检测显示细胞活力增强，流式细胞术显示凋亡减少。
**3.3 Olfml3通过Cybb介导的TLR4/NF-κB通路抑制IH处理的小胶质细胞炎症**
伪时间轨迹分析显示，Olfml3阴性小胶质细胞（Mic_Olfml3-）分布在分化后期，且Cybb表达显著上调。在BV2细胞中，Olfml3过表达下调Cybb mRNA和蛋白水平。救援实验表明，Olfml3过表达降低ROS水平，而Cybb过表达逆转此效应。WB结果显示，Olfml3过表达抑制TLR4蛋白和NF-κB p65磷酸化，而Cybb过表达重新激活该通路。
**3.4 Olfml3通过Cybb/TLR4/NF-κB轴抑制小胶质细胞炎症和神经元损伤**
通过敲低Olfml3，WB显示Cybb表达上调，TLR4/NF-κB通路激活，流式细胞术和ELISA表明M1极化增加、促炎因子升高。使用TLR4/NF-κB通路抑制剂IAXO-102处理后，Olfml3敲低引起的炎症反应显著减轻，神经元损伤（CCK-8和凋亡）得到改善，表明Olfml3通过该轴发挥作用。
**3.5 动物实验验证Olfml3通过Cybb介导的TLR4/NF-κB通路抑制小胶质细胞炎症和神经元损伤**
在IH小鼠模型中，脑室内注射Olfml3过表达慢病毒后，Morris水迷宫测试显示逃逸潜伏期缩短、目标象限停留时间增加、平台穿越次数增加，表明认知功能改善。Cybb过表达逆转此效应。HE染色显示Olfml3过表达维持海马神经元形态，TUNEL染色显示凋亡减少，Iba1免疫荧光显示小胶质细胞激活受抑。IHC证实Olfml3与Cybb表达负相关。ROS检测和WB表明Olfml3降低ROS水平、抑制TLR4/NF-κB通路。流式细胞术和ELISA显示Olfml3促进M2极化、减少促炎因子，Cybb过表达逆转这些保护作用。
**总结与讨论**
本研究通过整合scRNA-seq、体外和体内实验，证实Olfml3通过抑制Cybb介导的TLR4/NF-κB通路，促进小胶质细胞从M1向M2表型极化，从而减轻IH诱导的神经炎症和神经元损伤。该发现揭示了Olfml3在OSA中的神经保护作用，为靶向小胶质细胞极化的治疗策略提供了新方向。研究结论翻译如下：小胶质细胞中的Olfml3通过Cybb/TLR4/NF-κB轴减轻IH诱导的促炎激活和神经元损伤，从而对OSA相关的神经炎症提供神经保护。然而，研究存在局限性：缺乏临床样本验证，Olfml3调控Cybb的具体分子机制尚不明确，需进一步结合多组学和分子生物学方法阐明。
