丁酸钠通过H3K99ac/BDNF/TrkB通路减轻七氟烷诱导的新生小鼠髓鞘形成受损和神经行为缺陷

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Sodium Butyrate Attenuates Sevoflurane-Induced Impaired Myelination and Neurobehavioral Deficits in Neonatal Mice via the H3K9ac/BDNF/TrkB Pathway

　　

背景：早期生命暴露于七氟烷（sevoflurane）被认为是异常神经发育的重要危险因素，可能抑制新生小鼠少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的增殖与分化，导致髓鞘形成受损和神经行为缺陷。丁酸钠（NaB）是一种具有表观遗传调控活性的短链脂肪酸（SCFA），已在多种神经系统疾病中显示出神经保护作用，但NaB在七氟烷诱导的髓鞘损伤中的作用及潜在分子机制仍不清楚。方法：研究人员建立新生小鼠七氟烷暴露的体内模型，以研究其对髓鞘形成和神经行为功能的影响；随后给予NaB干预，评估其改善七氟烷诱导的髓鞘损伤和神经行为缺陷的潜力。体外实验中，研究人员直接以不同浓度NaB处理人少突胶质细胞前体细胞（HOPCs），检测其对细胞增殖、迁移、分化及相关分子信号通路的影响。结果：新生小鼠大脑发育关键期反复暴露于七氟烷，抑制了OPCs的增殖与分化，损害了髓鞘形成，并导致神经行为缺陷。NaB干预通过调节组蛋白H3赖氨酸9乙酰化（H3K9₉^ac）、上调脑源性神经营养因子（BDNF）表达、促进原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）磷酸化并增加磷酸化TrkB（p-TrkB）水平，从而改善了七氟烷诱导的髓鞘损伤和神经行为功能障碍。结论：新生小鼠反复暴露于七氟烷抑制了OPCs增殖与分化，损害了髓鞘形成，并导致神经行为缺陷。NaB通过调节H3K9₉^ac修饰、增加BDNF和p-TrkB水平改善了这些损伤。

**论文解读：丁酸钠通过H3K9ac/BDNF/TrkB通路减轻七氟烷诱导的新生小鼠髓鞘损伤与神经行为缺陷**

**研究背景与科学问题**

七氟烷（sevoflurane）因其起效快、可控性好、安全性高，成为婴幼儿手术中广泛使用的吸入性全身麻醉药。然而，大量证据表明，七氟烷具有潜在神经毒性，尤其在神经系统发育关键期（中枢神经系统（CNS）发育或神经退行性病变条件下）的不良效应尤为突出，临床主要表现为神经行为缺陷。婴幼儿麻醉安全是重大健康与社会关切。在啮齿动物中，髓鞘形成始于出生后第3天（P3），持续至约8周，其中P7–P21是少突胶质细胞前体细胞（OPCs）分化的关键窗口，大致对应人类婴儿1–6月龄。此期间暴露于吸入性全身麻醉药可能抑制OPCs分化，破坏髓鞘蛋白合成，导致髓鞘形成延迟和结构异常，进而造成神经传导的长期损害。

研究人员前期研究发现，新生小鼠连续3天每日暴露于3%七氟烷2小时，可导致肠道菌群失调，特征为产丁酸菌属Dwaynesavagella和Eubacterium_F显著减少，肠道内多种短链脂肪酸（SCFAs）水平下降，其中丁酸降幅最大且最持久。既往研究显示，抗生素诱导的肠道菌群失调和SCFAs水平降低可抑制未成熟少突胶质细胞（OLs）分化，而补充丁酸可部分逆转这些变化，但机制尚不明确。

组蛋白乙酰化是一种关键的表观遗传修饰，主要由组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）动态调控，与神经元分化、突触可塑性及学习记忆密切相关。丁酸作为天然HDAC抑制剂，可增加组蛋白乙酰化水平，促进染色质松驰，为转录因子和染色质重塑复合物提供结合位点，从而激活特定基因表达。BDNF是与神经元存活和突触可塑性密切相关的神经营养因子，通过结合其高亲和力受体TrkB并促进其磷酸化，激活下游信号通路，影响神经发育中的多个关键过程。

尽管已有研究显示丁酸通过调节组蛋白乙酰化发挥神经保护作用，但尚缺乏直接证据表明其作为连接七氟烷暴露与髓鞘损伤的关键中介因子。基于此，研究人员提出假设：七氟烷暴露可能通过降低内源性丁酸水平，抑制OPCs增殖与分化，导致异常髓鞘形成；而补充丁酸钠（NaB）可能通过增强组蛋白乙酰化、上调BDNF表达、增加p-TrkB水平，促进OPCs增殖与分化，从而改善髓鞘损伤并缓解神经行为缺陷。该研究从“肠道代谢物-表观遗传调控-髓鞘形成”轴的角度，建立了新的机制联系，为理解麻醉相关神经发育损伤提供了新视角。

**研究所采用的关键技术方法**

本研究使用C57BL/6J孕鼠（来源：吉林千和模型生物技术有限公司，许可证号SYXK [Ji] 2021-0003）建立新生小鼠反复七氟烷暴露模型（P6–P8，每天2小时，3%七氟烷）。主要方法包括：行为学测试（转棒试验、平衡木行走试验、物体位置识别测试（OLT）、新物体识别测试（NORT）、Morris水迷宫（MWM））；组织学与形态学分析（Luxol快蓝（LFB）染色、透射电镜（TEM）髓鞘超微结构观察、免疫荧光（IF）染色）；分子生物学检测（酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HDAC水平、气相色谱-质谱联用（GC–MS）分析血清SCFA、Western blot（WB）检测蛋白表达、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测mRNA表达、染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）检测H3K9ac在BDNF启动子区域的富集）以及体外培养人少突胶质细胞前体细胞（HOPCs）（来源：ScienCell, USA），采用CCK-8、流式细胞术（EdU法）、Transwell迁移实验、免疫细胞化学荧光检测（ICC-F）等评估NaB对HOPCs增殖、迁移和分化的直接效应。

**研究结果**

**3.1 反复七氟烷暴露诱导新生小鼠神经行为损伤**
通过行为学测试发现，七氟烷暴露组小鼠在转棒试验中掉落潜伏期显著缩短（t=3.222, p=0.0047），平衡木行走试验中穿越时间延长、滑足次数增加（t=3.787, p=0.0013; t=2.595, p=0.0183），物体位置识别测试（OLT）和新物体识别测试（NORT）显示空间记忆、短期记忆和长期记忆均受损，Morris水迷宫（MWM）中逃逸潜伏期延长、平台穿越次数和目标象限停留时间减少（U=26, p=0.046; t=2.838, p=0.0109），表明反复七氟烷暴露导致运动协调、平衡、精细运动控制及学习记忆能力全面下降。

**3.2 反复七氟烷暴露抑制OPCs增殖与分化，损害髓鞘形成**
免疫荧光（IF）染色显示，七氟烷组PDGFRα阳性细胞增加（t=2.856, p=0.0461），BrdU/PDGFRα双阳性细胞减少（t=4.279, p=0.0129），Olig2阳性细胞和CC1/Olig2双阳性细胞均减少（t=3.511, p=0.0246; t=8.369, p=0.0011），Western blot（WB）进一步证实PDGFRα蛋白升高，Olig2和CNPase蛋白降低，RT-qPCR显示SOX10和Myrf mRNA表达下降。LFB染色显示胼胝体神经纤维稀疏、不连续、变薄，TEM显示髓鞘g-ratio显著升高（t=13.42, p<0.0001），MBP表达下降，说明七氟烷抑制OPCs增殖分化，破坏髓鞘结构完整性。

**3.3 ANA-12减弱NaB对反复七氟烷暴露所致神经行为损伤的保护作用**
通过口服灌胃NaB（P9–P29）并联合腹腔注射TrkB拮抗剂ANA-12，血清SCFA分析显示NaB部分逆转了七氟烷引起的丁酸水平下降（F=8.383, p=0.0008）。行为学结果显示，NaB显著延长了转棒试验潜伏期、缩短了平衡木穿越时间、减少了滑足次数，并恢复了OLT和NORT中的记忆能力，以及MWM中的学习与记忆表现；而ANA-12显著削弱了这些保护效应，表明NaB通过激活TrkB依赖性信号通路缓解神经行为损伤。

**3.4 ANA-12减弱NaB对七氟烷所致OPCs增殖分化抑制和髓鞘缺陷的保护作用**
IF和WB结果显示，NaB降低了七氟烷引起的PDGFRα阳性细胞增多，增加了BrdU/PDGFRα双阳性细胞，恢复了Olig2和CC1/Olig2双阳性细胞数量，上调了Olig2、CNPase蛋白及SOX10、Myrf mRNA表达，减轻了LFB染色的髓鞘病理改变，降低了g-ratio，恢复了MBP表达；而ANA-12完全消除了这些保护作用，表明NaB至少部分通过BDNF/TrkB信号通路改善OPCs功能与髓鞘形成。

**3.5 NaB恢复反复七氟烷暴露所致BDNF、p-TrkB和组蛋白乙酰化水平降低**
IF和WB显示，七氟烷暴露降低海马BDNF和p-TrkB表达，NaB处理恢复其水平；ELISA显示七氟烷升高HDAC总水平，NaB降低之；WB进一步显示七氟烷升高HDAC3和HDAC8蛋白，NaB降低之；H3K9ac阳性细胞及H3K9ac/Olig2双阳性细胞在七氟烷组减少，NaB恢复之，WB也证实此趋势，表明NaB通过抑制HDAC活性、增加H3K9ac水平，进而上调BDNF/TrkB信号。

**3.6 NaB浓度依赖性上调HOPCs中H3K9ac修饰、BDNF表达和p-TrkB水平，增加H3K9ac在BDNF启动子上的富集，促进HOPCs增殖、迁移和分化**
体外实验显示，NaB在100–500 μΜ浓度范围内显著增加HOPCs中H3K9ac、BDNF和p-TrkB蛋白表达，并上调BDNF mRNA；ChIP-qPCR证实NaB增加H3K9ac在BDNF启动子区域的结合富集；CCK-8、流式（EdU）显示500 μΜ NaB促进增殖；划痕和Transwell实验显示NaB促进迁移；IF和WB显示NaB促进HOPCs向成熟OLs分化，上调MBP等蛋白，表明NaB通过表观遗传调控直接促进OPCs功能。

**讨论与结论**

本研究证实，新生小鼠反复七氟烷暴露抑制OPCs增殖与分化，损害髓鞘形成，导致神经行为缺陷。该暴露降低丁酸产量，导致H3K9ac修饰改变，损害BDNF启动子区域染色质可及性，破坏BDNF/TrkB信号传导。NaB干预通过抑制HDAC（尤其是HDAC3和HDAC8）、增加H3K9ac水平、促进BDNF转录激活及TrkB磷酸化，显著改善上述异常，而TrkB拮抗剂ANA-12可阻断此保护效应，表明NaB的神经保护作用至少部分依赖于BDNF/TrkB通路激活。该研究首次揭示丁酸在七氟烷诱导神经发育损伤中作为关键中介因子的作用，并阐明了H3K9ac/BDNF/TrkB信号轴在调控OPCs增殖分化中的重要性，为麻醉相关神经毒性提供了新的潜在治疗靶点。研究结论：反复新生期七氟烷暴露抑制OPCs增殖与分化，损害髓鞘形成，最终导致神经行为缺陷；此类暴露降低丁酸产量，引起H3K9ac修饰改变，损害BDNF启动子区域染色质可及性，破坏正常BDNF/TrkB信号；作为神经发育的关键调控通路，BDNF/TrkB信号在维持髓鞘形成和神经行为功能中发挥核心作用。