连续θ短脉冲刺激(continuous theta-burst stimulation, cTBS)通过调节钙调磷酸酶(Calcineurin)/AKT/FOXO1信号通路在缺血性脑卒中急性期发挥神经保护作用的机制研究

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：The Protective Mechanism of Continuous Theta Burst Stimulation in the Acute Phase of Stroke Through Modulation of the Calcineurin/AKT/FOXO1 Signaling Pathway

　　

摘要： 目的：探讨连续θ短脉冲刺激(continuous theta-burst stimulation, cTBS)在缺血性卒中急性期是否具有神经保护作用，及其对梗死周围区(peri-infarct region)神经元凋亡的影响。 方法：采用Longa线栓法建立小鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，术后每日给予cTBS干预共7天。通过行为学检测评估运动功能与肢体协调性；对梗死周围区进行转录组学与蛋白质组学分析以探索潜在机制；采用免疫荧光与Western blot检测钙调磷酸酶(Calcineurin)/AKT/FOXO1信号通路关键蛋白表达；TUNEL染色评估神经元凋亡；利用腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)介导的基因敲低验证该通路在凋亡调控中的作用。 结果：cTBS可改善运动功能、减小梗死体积、维持梗死周围区组织学结构；cTBS抑制钙调磷酸酶(Calcineurin)表达，增强Calcineurin/AKT/FOXO1通路活化，减少神经元凋亡。 结论：cTBS通过调控Calcineurin/AKT/FOXO1信号通路，最终抑制梗死周围区神经元凋亡，发挥神经保护作用。

论文解读：

研究背景与立题依据

急性缺血性卒中的主要治疗手段是血管再通疗法，但因治疗时间窗狭窄，仅约15%–30%患者能获益。卒中急性期的主要病理特征为兴奋性毒性(excitotoxicity)，谷氨酸过度释放导致神经元超兴奋，使缺血核心向周围缺血半暗带(peri-infarct region / ischemic penumbra)扩展，诱发神经元凋亡。FOXO1(Forkhead Box Protein O1)系叉头框转录因子，可被PI3K/AKT信号通路磷酸化(Ser²⁵⁶)后发生胞核转出及胞质扣留，从而下调其转录活性；活化的PI3K/AKT/FOXO1轴可抑制铁死亡、增强线粒体自噬并减少细胞凋亡，但其在卒中神经元中的作用尚不清楚。重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS)中，连续θ短脉冲刺激(continuous theta-burst stimulation, cTBS)属抑制性方案，理论上可降低急性期兴奋性毒性及相关信号紊乱。因此研究人员假设cTBS可通过抑制梗死周围区兴奋性毒性、上调PI3K/AKT/FOXO1信号通路，减少神经元凋亡发挥神经保护效应。本研究旨在从动物行为学、组织病理学、多组学及分子生物学层面阐明cTBS通过Calcineurin(钙调磷酸酶)/AKT/FOXO1信号通路调控外源性凋亡(extrinsic apoptosis)的机制，论文发表于《CNS Neuroscience & Therapeutics》。

主要关键技术方法

研究选用雄性C57BL/6小鼠，采用Longa法建立左侧大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型；术后3 h开始每日给予cTBS（50 Hz三相簇每200 ms重复，持续5 min，连续7天），假刺激组线圈距头顶15 cm模拟声学效应。行为学评价包括改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score, mNSS)、Rotarod测试、网格行走(Grid Walking)测试、旷场实验(Open Field Test, OFT)及CatWalk步态分析。组织学检测含TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色测梗死体积、HE与尼氏(Nissl)染色观察组织结构、TUNEL染色及NeuN共标检测神经元凋亡、免疫组化(IHC)与免疫荧光(IF)检测Calcineurin、FOXO1核质转位及FasL表达。Western blot检测PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT(Ser⁴⁷³)、FOXO1/p-FOXO1(Ser²⁵⁶)、Calcineurin、FasL、Caspase-8(Casp8)、Cleaved-Caspase-3(Cleaved-casp3)。转录组测序(RNA-seq)与数据非依赖采集质谱(DIA–nanoLC-MS/MS)蛋白质组学并行分析差异表达基因(DEGs)与差异表达蛋白(DEPs)，行GO与KEGG富集及GSEA分析。采用AAV-shRNA敲低神经元Calcineurin及AAV-hM4Di/hM3Dq双向调控神经元钙活动，MK-2206(AKT抑制剂)阻断通路验证；染色质免疫沉淀qPCR(ChIP–qPCR)检测FOXO1与FasL启动子结合。统计采用Student t检验及单因素/双因素方差分析(one-way/two-way ANOVA)加Tukey多重比较，p＜0.05为差异显著。

研究结果

3.1 cTBS Improves Health Status, Motor Function, and Exploratory Abilities in MCAO/R Mice

cTBS干预显著提高MCAO小鼠存活率(p=0.017)，减轻术后体重波动，降低TTC染色梗死体积(p＜0.001)；mNSS评分降低(p＜0.001)，Rotarod落棒潜伏期延长(p＜0.0001)，网格行走跌落潜伏期延长(p＜0.01)，OFT运动轨迹更密集，CatWalk示对侧肢体步幅与协调改善。表明cTBS对MCAO/R小鼠具明确神经保护作用。

3.2 Transcriptomic and Proteomic Analyses Suggest That cTBS May Exert Neuroprotective Effects Through Calcium Signaling Pathway and Apoptosis

梗死周围区转录组学鉴定993个上调与2432个下调基因，蛋白质组学鉴定437个上调与335个下调蛋白。GO/KEGG富集共聚焦钙信号通路(Calcium signaling pathway)、凋亡(Apoptosis)、FOXO信号通路及突触活动。GSEA显示cTBS显著抑制凋亡基因集富集。整合GEO数据集时序聚类与蛋白互作网络(PPI)提示外源性凋亡关键节点为FasL与Casp8，GSEA示cTBS抑制Caspase Activation via extrinsic apoptosis signaling pathway，提示cTBS可能通过抑制此外源性凋亡过程减轻神经元丢失。

3.3 cTBS Preserves Post-Ischemic Brain Tissue Structure and Reduces the Expression of FasL-Associated Apoptotic Proteins

HE与Nissl染色示cTBS减轻缺血所致形态损伤，增加海马、皮质及CA1区尼氏体数量。TUNEL示cTBS显著减少梗死周围区凋亡神经元(p＜0.001)。凋亡蛋白芯片与Western blot证实cTBS下调BIM、Caspase-3、Fas、FasL(p＜0.05～0.0001)及Casp8、Cleaved-casp3(p＜0.001)；IHC与IF示皮质、CA1、DG区FasL阳性细胞减少(p＜0.001)，NeuN与FasL共标示神经元内FasL表达被抑制(p＜0.001)。表明cTBS通过抑制FasL介导的外源性凋亡发挥神经保护。

3.4 cTBS Attenuates the Expression of FasL-Associated Apoptotic Proteins Through Activation of the AKT/FOXO1 Signaling Pathway

FasL为FOXO1靶基因。Western blot示cTBS提高p-AKT/AKT(p＜0.01)与p-FOXO1(Ser²⁵⁶)/FOXO1比值(p＜0.001)，p-PI3K/PI3K无显著差异；IF示FOXO1由核转至胞质。用AKT抑制剂MK-2206处理后，cTBS减少TUNEL阳性细胞及抑制FasL的作用被逆转(p＜0.001)，证明cTBS通过激活AKT/FOXO1轴磷酸化FOXO1、阻遏FasL转录，抑制外源性凋亡。

3.5 During the Acute Phase of Ischemic Stroke, cTBS Activates the AKT/FOXO1 Signaling Pathway by Inhibiting the Calcium Signaling Pathway

转录组与蛋白组提示钙信号参与上游调控。AAV-hM4Di抑制钙信号缩小梗死体积、增p-FOXO1/FOXO1(p＜0.001)；AAV-hM3Dq增强钙信号联合cTBS则抵消cTBS对梗死体积、组织学及TUNEL的保护作用(p＜0.001)，并降低p-AKT/AKT与p-FOXO1/FOXO1(p＜0.001)，p-PI3K/PI3K仍无变化。ChIP–qPCR证实增强钙信号解除cTBS对FOXO1–FasL启动子结合的抑制。表明cTBS通过抑制神经元钙信号活动，不依赖PI3K而促进AKT磷酸化，激活AKT/FOXO1通路。

3.6 cTBS Exerts Neuroprotective Effects by Activating the Calcineurin/AKT/FOXO1 Signaling Pathway, Thereby Inhibiting Neuronal Apoptosis

Calcineurin(钙调磷酸酶/CaN，即蛋白磷酸酶2B, PP2B)为Ca²⁺依赖性丝/苏氨酸磷酸酶，可去磷酸化AKT抑制其活化。WB、IHC、IF示梗死周围区Calcineurin高表达，cTBS显著下调之(p＜0.001)。AAV介导神经元Calcineurin敲低缩梗死体积(p＜0.001)、保存组织结构、升高p-AKT/AKT与p-FOXO1/FOXO1(p＜0.001)、下调FasL/Casp8/Cleaved-casp3(p＜0.01)并减少TUNEL阳性细胞(p＜0.001)。证实cTBS通过抑制钙依赖性Calcineurin表达解除其对AKT的抑制，激活AKT/FOXO1通路，抑制FasL驱动的外源性凋亡。

讨论与结论总结

讨论指出cTBS作为抑制性rTMS方案可降低神经元兴奋性，适合用于卒中急性期患侧半球干预。行为学与多组学共同锁定钙信号与凋亡为核心机制，GSEA确认cTBS抑制梗死周围神经元凋亡；FasL为FOXO1靶基因，cTBS通过PI3K/AKT/FOXO1轴磷酸化FOXO1将其滞留于胞质，阻遏FasL转录与外源性凋亡级联；上游钙信号受cTBS抑制，AAV双向调控验证钙信号位于AKT/FOXO1上游；Ca²⁺依赖性Calcineurin在缺血急性期高表达并拮抗AKT磷酸化，cTBS下调Calcineurin解除此抑制，激活AKT/FOXO1通路并抑制FasL/Casp8/Cleaved-casp3介导的凋亡。研究局限含未实时监测胞内Ca²⁺动态、未全面探讨胶质细胞互作及其他并存通路。Calcineurin可作为急性缺血性卒中潜在干预靶点。

结论(翻译)：cTBS通过下调钙信号关键分子钙调磷酸酶(Calcineurin)的表达，激活AKT/FOXO1信号通路，抑制梗死周围区FasL介导的外源性神经元凋亡，从而在缺血性脑卒中急性期发挥神经保护作用。