使用聚乳酸-泊洛沙姆188纳米载体进行鼻脑递送β-淀粉样蛋白阻断肽

《Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine》：Nose-to-brain delivery of an amyloid beta blocking peptide using polylactic acid-poloxamer 188 nanocarriers

　　

背景：阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）以进行性认知功能下降为特征，是全球主要的健康挑战。一种新型阻断肽（blocking peptide, BP）（序列：KRKKSRYKSWSVYVG）能与早期疾病发病机制中涉及的有毒β-淀粉样蛋白寡聚体（amyloid beta oligomers, Aβo）高亲和力结合，已显示出有前景的治疗潜力。为了克服脑部药物递送的挑战，将纳米颗粒（nanoparticles, NPs）与鼻脑递送（nose-to-brain delivery）方法相结合，以增强脑部生物分布和药物递送效率。在本研究中，研究人员评估了使用这些纳米颗粒将阻断肽递送至大脑的可行性。
结果：由聚乳酸（polylactic acid, PLA）和泊洛沙姆P188（poloxamer P188）组成的纳米颗粒被成功合成，并通过表面吸附的阻断肽进行功能化，表现出适合鼻脑递送的物理化学特性。纳米颗粒保持了阻断肽抗β-淀粉样蛋白（amyloid beta, Aβ）聚集的治疗活性，此外，还保护其免受酶降解。功能性细胞评估显示，纳米颗粒-阻断肽复合物具有生物相容性，并能被神经元细胞潜在内化。重要的是，体内实验证明了纳米颗粒从鼻腔成功递送至大脑，代表了靶向脑递送的显著进步。
结论：功能化抗β-淀粉样蛋白聚集肽的纳米颗粒在鼻内给药后成功到达大脑，提示其作为针对阿尔茨海默病的治疗策略的潜力。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种以进行性认知功能下降为特征的神经退行性疾病，被世界卫生组织列为“全球公共卫生优先事项”。其病理机制主要涉及脑内两种蛋白聚集体的积累：由Tau蛋白过度磷酸化导致的神经原纤维缠结，以及由β-淀粉样蛋白（amyloid beta, Aβ）肽沉积形成的淀粉样斑块。淀粉样级联假说认为，AD起始于Aβ的积累，进而触发Tau病理和神经元变性。Aβ肽由淀粉样前体蛋白经分泌酶切割产生，形成Aβ单体（Aβ monomer, Aβm）释放至细胞外，并逐步聚集为寡聚体（Aβ oligomer, Aβo）、原纤维和纤维。其中，可溶性Aβo被证实比纤维更具神经和突触毒性，是AD的主要致病物种。因此，靶向Aβ肽向毒性Aβo的聚集是开发AD新疗法的关键。近年来，一种新型治疗性肽——阻断肽（blocking peptide, BP）（序列：KRKKSRYKSWSVYVG）被开发，通过特异性高亲和力结合有效阻止Aβ向毒性Aβo的聚集，并在AD小鼠模型中抑制突触靶向Aβo的形成、恢复突触可塑性，显示出作为AD治疗候选药物的潜力。然而，脑靶向药物递送的主要挑战是提高其在中枢神经系统的生物利用度，因为血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）阻止分子穿过内皮，限制了药物到达靶点的量。鼻内给药（intranasal administration, INA）可绕过BBB，通过嗅觉和/或三叉神经通路将药物直接递送至大脑，具有非侵入性、安全性高、患者依从性好等优势。但鼻腔中存在多种代谢酶（如蛋白酶）以及黏液和黏液纤毛清除机制，会降解或清除药物，降低其停留时间和脑递送效率。纳米颗粒（nanoparticles, NPs）可弥补这些不足，增强药物稳定性、促进细胞摄取和靶向递送。研究人员利用聚乳酸（polylactic acid, PLA）和泊洛沙姆188（poloxamer 188, P188）制备的聚合物纳米颗粒，结合鼻脑递送策略，旨在高效递送BP至大脑。该研究发表在《Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine》上。

研究人员开展研究，通过纳米沉淀法合成PLA-P188纳米颗粒，并将BP通过被动吸附功能化其表面，系统评估了该递送系统的理化特性、抗Aβ聚集活性、酶降解保护能力、细胞相容性及体内脑靶向能力。主要关键技术方法包括：动态光散射（dynamic light scattering, DLS）和电泳光散射用于表征纳米颗粒的粒径、多分散指数（polydispersity index, PDI）和Zeta电位；Western blot分析评估BP对Aβ₄₂聚集的抑制效果；Dot blot检测纳米颗粒对BP在人类诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell, hiPSC）来源神经元条件培养基（conditioned media, CM）中的酶降解保护作用；流式细胞术评估RPMI 2650人鼻上皮细胞（购自ATCC）和PC12大鼠嗜铬细胞瘤细胞（购自ATCC）分化神经元对荧光标记纳米颗粒的摄取；体内生物分布采用近红外荧光成像（DIR标记）对SKH1雌性小鼠（Charles River Laboratories, France）进行监测；脑组织切片通过荧光显微镜结合抗GAP-43免疫染色观察纳米颗粒在嗅球和前额叶皮层的分布。

**结果**
1. **阻断肽吸附于聚合物纳米颗粒；物理化学特性适合鼻脑递送**：通过DLS测定，NP和NP-BP的平均水动力学直径约100 nm，PDI小于0.15，表明尺寸均一、分布窄。Zeta电位测量显示两者均为负电荷，且NP-BP的表面电荷略有增加，提示BP成功吸附。吸附效率高达98.7% ± 0.4%。NP-BP在4°C下保存7天，直径、PDI、表面电荷和吸附率均保持稳定。在37°C的人工黏液、人工脑脊液、水和PBS中，BP从NPs的释放曲线显示：在人工黏液中释放较快（30 min释放47% ± 8%，24 h达77% ± 17%），但在其他介质中释放缓慢（24 h释放22%-28%），表明在鼻腔停留时间内足以实现鼻脑递送。
2. **纳米颗粒不影响阻断肽对Aβ聚集过程的活性**：将Aβ₄₂单体与BP、NP-BP或NP单独孵育2 h后，Western blot分析显示，与Aβ单独组相比，BP和NP-BP均显著降低高分子量（high molecular weight, HMW）Aβo的比例（从80.5% ± 7.7%分别降至52.2% ± 18.6%和50.0% ± 16.2%），同时增加低分子量（low molecular weight, LMW）Aβo和Aβm的比例。NP单独处理则无影响，证明BP吸附于NPs后仍保留抗Aβ聚集活性。
3. **纳米颗粒保护BP免受酶降解**：将生物素化BP（bBP）或NP-bBP与hiPSC来源神经元条件培养基（CM）孵育30 min后，Dot blot检测显示，bBP在CM中信号强度显著降低，表明发生酶降解；而NP-bBP信号强度与PBS对照组相当，证明NPs可有效保护BP免受神经元分泌酶的降解。
4. **体外细胞毒性和细胞摄取**：在RPMI 2650鼻上皮细胞和分化PC12神经元中，NP和NP-BP处理24 h后均未引起细胞活力下降（Presto Blue法）。流式细胞术显示，NPs在RPMI 2650细胞中的内化率较低（1 h: 1.38% ± 0.69%；3 h: 2.35% ± 2.16%），而在PC12神经元中内化率较高（1 h: 40.02% ± 33.90%；3 h: 61.04% ± 33.96%）。BP的加入未显著改变两种细胞的内化率，表明BP不影响NPs的细胞摄取。
5. **体内生物分布和组织积累**：**生物分布**：DIR荧光NPs经INA给药后，活体近红外成像显示，信号在鼻腔区域集中，未进入下呼吸道或肺部。1 h至6 h内信号逐渐减弱，但始终局限于鼻腔，表明NPs缓慢清除，并可能通过嗅觉上皮进入大脑。**高效递送至不同脑区**：DY650荧光NPs（含或不含BP）给药1 h和3 h后，脑切片荧光显微镜观察显示，红色荧光信号在嗅球颗粒层和前额叶皮层均清晰可见，且两种制剂分布模式相似，证明BP不影响NPs沿嗅觉通路向脑的运输。

**讨论与结论**
**讨论**：研究人员指出，NP-BP的尺寸（~100 nm）、负电荷和均质性有利于鼻脑递送，因为小粒径和负电荷可优先利用较快的嗅觉通路到达嗅球。BP吸附于NPs后仍能有效限制毒性HMW Aβo的形成，保留治疗活性。NPs还保护BP免受神经元酶降解，增强其稳定性和生物利用度。细胞实验表明NP-BP无细胞毒性，且神经元内化率较高，提示其可能通过细胞内运输从鼻腔进入脑。体内实验证实NPs（无论是否偶联BP）在INA后快速到达嗅球和前额叶皮层，为AD的非侵入性治疗提供了潜在策略。
**结论**：本研究开发了一种基于PLA和P188 NPs的鼻内纳米载体递送系统，用于运载抗β-淀粉样蛋白聚集BP。所得NPs具有良好的理化性质，有效保护肽免受酶降解，同时保留BP的治疗活性。其对上皮细胞的低内化率和神经元的高摄取表明，从鼻腔到脑的细胞内运输是一条有前景的途径。体内证据显示，NPs（无论是否偶联BP）迅速到达嗅球并扩散至脑。这些发现证实了该策略用于AD非侵入性治疗递送的潜力。