Picroside II通过调节Notch1信号通路抑制结直肠癌细胞进展

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Inhibition of Colorectal Cancer Cell Progression by Picroside II Through Modulation of the Notch1 Signaling Pathway

　　

本研究旨在探讨Picroside II对结直肠癌（CRC）细胞的生物学效应，包括其对增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）的影响，并探讨其作用机制是否涉及调节Notch1信号通路。人类CRC细胞系SW480和SW620用不同浓度的Picroside II（10–100 μM）处理。使用CCK-8实验、集落形成实验和EdU掺入实验评估细胞增殖。通过伤口愈合实验和Transwell实验评估迁移和侵袭能力。使用Western blotting分析EMT相关标志物（E-钙粘蛋白（E-cadherin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、ZEB2）和Notch1通路关键蛋白（Notch1、Cleaved Notch1、RBP、HES1）的表达水平。使用单因素方差分析和Student's t检验进行统计分析。Picroside II以剂量和时间依赖性方式抑制SW480和SW620细胞的增殖，降低集落形成能力，并减少DNA合成活性。Picroside II处理抑制了CRC细胞的迁移和侵袭能力，同时伴随E-钙粘蛋白上调和N-钙粘蛋白、波形蛋白、ZEB2下调。此外，Picroside II暴露导致Notch1、Cleaved Notch1、RBP和HES1蛋白表达呈浓度依赖性下降。Picroside II通过抑制Notch1信号通路在体外抑制CRC细胞进展，为进一步的体内研究提供了初步的分子基础。

**研究背景与目的**
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因，在发达国家和发展中国家均造成巨大临床负担。尽管早期诊断、手术、化疗和放疗技术不断进步，但晚期或转移性CRC患者的预后仍不理想，标准治疗方案如手术联合全身化疗和放疗常伴随骨髓抑制、胃肠道紊乱和外周神经病变等严重毒性，影响患者生活质量。此外，以奥沙利铂和5-氟尿嘧啶为代表的化疗药物易产生耐药性，而针对表皮生长因子受体（EGFR）和血管内皮生长因子（VEGF）的靶向治疗也面临内在和获得性耐药的限制。因此，开发具有低毒性和新作用机制的替代治疗策略是CRC研究的重要方向。

上皮-间质转化（EMT）是上皮细胞获得间充质特征的过程，导致迁移能力、侵袭能力和抗凋亡能力增强，是驱动CRC转移和进展的核心机制。EMT过程中，上皮标志物如E-钙粘蛋白（E-cadherin）下调，间充质标志物如N-钙粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）上调，促进细胞从原发灶脱离并向远处扩散。多种信号通路参与EMT调控，其中Notch1信号通路在CRC中异常激活，通过抑制上皮标志物和增强间充质特性促进EMT，且其持续活化与患者不良预后相关。因此，抑制Notch1信号被视为限制EMT介导转移的潜在策略。

天然产物是抗癌药物的重要来源，其中从胡黄连（Picrorhiza scrophulariiflora）中提取的主要环烯醚萜苷Picroside II已显示出抗炎和抗氧化活性，但在CRC中的抗肿瘤作用尚不明确。基于EMT和Notch1通路在CRC转移中的关键作用，研究人员开展了本研究，旨在评估Picroside II对CRC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的影响，并探讨其作用是否涉及调控Notch1信号通路。

**研究内容与结论**
研究人员使用人类CRC细胞系SW480和SW620作为体外模型，通过CCK-8实验、集落形成实验和EdU掺入实验检测细胞增殖；通过伤口愈合实验和Transwell实验评估迁移和侵袭能力；通过Western blot分析EMT标志物和Notch通路蛋白表达；并通过NICD（Notch胞内结构域）过表达实验验证机制。主要结论为：Picroside II以剂量和时间依赖性方式抑制CRC细胞增殖，降低集落形成能力和DNA合成活性；抑制细胞迁移和侵袭，同时上调E-钙粘蛋白、下调N-钙粘蛋白、波形蛋白和ZEB2；下调Notch1、Cleaved Notch1、RBP和HES1蛋白表达；NICD过表达部分逆转Picroside II引起的EMT标志物变化，提示Picroside II通过抑制Notch1信号通路发挥抗CRC作用。该研究发表于《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》，为Picroside II作为CRC治疗候选化合物提供了体外分子基础，但需进一步体内验证。

**主要技术方法**
研究采用以下关键实验技术：CCK-8实验测定细胞活力并计算IC₅₀；集落形成实验评估长期克隆原生存能力；EdU掺入实验检测DNA合成活性；伤口愈合实验和Transwell迁移/侵袭实验（使用Matrigel包被）评估二维和三维迁移及基质降解能力；Western blotting检测蛋白表达，以β-肌动蛋白为内参。所有实验均使用SW480和SW620细胞系（来源未注明），未涉及患者样本队列。

**研究结果**
**3.1 Picroside II抑制CRC细胞增殖**
通过CCK-8实验，研究人员观察到Picroside II处理导致SW480和SW620细胞活力呈剂量和时间依赖性下降。在SW480细胞中，25 μM浓度的抑制率为50.2% ± 3.1%，IC₅₀在24、48和72 h分别为27.1、17.4和13.6 μM；SW620细胞中相应值为55.2% ± 2.8%和28.9、19.5、14.2 μM。集落形成实验显示，10、25和100 μM Picroside II将SW480细胞的集落数降至对照的66.1%、47.5%和32.4%；SW620细胞降至73.8%、55.2%和35.6%。EdU掺入实验表明，Picroside II呈浓度依赖性降低EdU阳性细胞比例，在SW480细胞中从对照的49.3%降至25.6%（100 μM），SW620细胞中从56.7%降至26.3%。这些结果说明Picroside II通过抑制代谢活性、克隆原性和DNA合成来阻止CRC细胞增殖。

**3.2 Picroside II抑制CRC细胞迁移和侵袭**
伤口愈合实验中，Picroside II处理48 h后，SW480细胞的相对迁移率从对照的69.4%降至100 μM时的9.6%；SW620细胞从64.1%降至8.1%。Transwell迁移实验显示，Picroside II将SW480细胞的迁移百分比从100%降至100 μM时的26.3%；SW620细胞从100%降至20.4%。Matrigel侵袭实验中，SW480细胞的相对侵袭率从100%降至19.8%；SW620细胞从100%降至15.7%。所有高剂量组（100 μM）差异具有统计学意义（p < 0.01），但研究人员指出100 μM高于IC₅₀，可能部分反映细胞毒性，而10和25 μM的结果更能体现特异性抗迁移/抗侵袭效应。这些结果表明Picroside II抑制CRC细胞的两维和三维迁移及基质降解能力。

**3.3 Picroside II调节EMT和Notch信号通路**
Western blot结果显示，Picroside II处理48 h后，SW480细胞中E-钙粘蛋白表达从0.91增至1.37（100 μM），而ZEB2、N-钙粘蛋白和波形蛋白分别从1.11降至0.56、1.02降至0.59、1.05降至0.48；SW620细胞中E-钙粘蛋白从0.59升至1.35，ZEB2从1.04降至0.73，N-钙粘蛋白从1.05降至0.61，波形蛋白从1.21降至0.62。在Notch通路方面，SW480细胞中Notch1从0.97降至0.54，Cleaved Notch1从0.72降至0.22，RBP从1.08降至0.64，HES1从1.12降至0.69；SW620细胞中Notch1从1.23降至0.75，Cleaved Notch1从0.97降至0.29，RBP从1.16降至0.55，HES1从1.10降至0.61。所有变化呈浓度依赖性，Cleaved Notch1下降最显著。0.1% DMSO对照无明显影响。这些结果说明Picroside II上调上皮标志物、下调间充质标志物，并抑制Notch1通路关键蛋白表达。

**3.4 NICD过表达部分逆转Picroside II诱导的蛋白变化**
为验证Picroside II是否通过Notch1信号发挥作用，研究人员进行NICD过表达实验。与对照相比，Picroside II将NICD表达降至约0.35倍，HES1降至约0.30倍，E-钙粘蛋白升至约2.05倍，波形蛋白降至约0.30倍。NICD过表达单独使NICD升至约2.10倍，HES1升至约2.00倍，E-钙粘蛋白降至约0.50倍，波形蛋白升至约1.70倍。在Picroside II加NICD过表达组中，NICD和HES1分别恢复至约1.40和1.20倍，E-钙粘蛋白和波形蛋白分别恢复至约1.10和0.95倍，显著高于Picroside II组但低于NICD过表达组。N-钙粘蛋白和ZEB2趋势相似。统计分析显示各组间差异显著（p < 0.05）。该部分结果表明，Notch1信号参与了Picroside II对EMT标志物的调控，但部分逆转提示可能涉及其他通路。

**讨论与结论**
讨论部分指出，CRC仍然是全球重大临床挑战，本研究通过多种体外实验系统评估了Picroside II的生物学活性。Picroside II抑制CRC细胞增殖、集落形成和DNA合成，其作用可能涉及线粒体功能干扰和细胞周期阻滞。迁移和侵袭抑制实验显示Picroside II影响细胞骨架动力学、黏附重塑、趋化信号及基质金属蛋白酶活性，但100 μM较高浓度可能含有细胞毒效应。Notch1信号通路在CRC中异常激活，Picroside II显著降低Notch1及其活性形式Cleaved Notch1，并下调下游转录效应因子RBPJ和HES1，提示其可能干扰γ-分泌酶介导的蛋白水解裂解过程。SW620细胞对Notch1抑制更敏感，可能与其转移源和基线Notch1活性较高有关。NICD过表达部分逆转Picroside II的EMT调控，证实Notch1通路参与，但部分性表明Picroside II可能通过Wnt/β-连环蛋白、TGF-β、PI3K/AKT等其他通路发挥作用。

研究局限性包括：仅使用两种CRC细胞系的体外实验，未包含动物模型或肿瘤微环境因素；未明确Picroside II直接作用于Notch级联还是间接调控上游因子；未评估100 μM浓度下的细胞毒性特异性（如LDH释放或活/死染色）；未进行药代动力学、组织分布和正常组织毒性分析。因此，Picroside II的体内抗肿瘤活性、安全性和临床转化潜力尚待进一步研究。

**结论**：总之，本研究证明Picroside II在体外抑制CRC细胞活力、迁移、侵袭和EMT相关变化。这些效应与Notch1信号通路下调相关。需要进一步的体内验证和安全性评估以确定其治疗相关性。