非遗传毒性移植与通过表位编辑的体内选择

《Nature》：Non-genotoxic transplantation and in vivo selection through epitope editing

　　

摘要：遗传毒性预处理的短期和长期效应仍然是造血干细胞/祖细胞（HSPC）移植和基因治疗更广泛应用的主要障碍。尽管靶向KIT的单克隆抗体（mAb）已被提议作为化疗或放疗的替代方案，但其药代动力学因存在耗竭移植HSPC的风险而阻碍了临床转化。为解决这一问题，研究人员鉴定了KIT胞外结构域中能够破坏两种治疗性mAb结合的氨基酸变化，这些变化在不影响KIT表达或功能的情况下削弱了干细胞因子（SCF）介导的信号传导。研究人员利用腺嘌呤碱基编辑（ABE）或先导编辑（PE）在HSPC中高效引入这些突变，并将其与破坏BCL11A红系增强子相结合，以促进胎儿血红蛋白（HbF）的表达，这是针对多种血红蛋白病的治疗方法。该策略能够实现基因工程细胞的体内共选择，使其达到为镰状细胞病（SCD）和β-地中海贫血患者提供治疗益处所需的阈值。研究人员展示了在抗KIT mAb的选择压力下，KIT和BCL11A多重编辑的造血作用在体外和体内逐渐富集。研究人员报告，延长抗KIT方案的治疗可导致更好的体内富集，同时避免克隆选择，这一点通过慢病毒条形码文库进行了评估。最后，通过克服mAb药代动力学的限制，表位编辑使得新型造血替换方案成为可能，这些方案不受靶向移植物消除的限制，允许延长基于免疫的预处理，从而在没有化疗-放疗或mAb洗脱的情况下最大化清除造血生态位。

表位编辑技术通过非遗传毒性免疫预处理实现造血干细胞/祖细胞（HSPC）移植与体内基因编辑细胞富集，是克服传统遗传毒性预处理毒副作用的关键突破。尽管基于KIT抗体（如briquilimab）的免疫疗法已显示潜力，但其药代动力学导致移植后HSPC耗竭，限制了临床转化。研究人员在KIT胞外域（ECD）引入点突变（H378R、D121L、S123P），使其不识别治疗性单克隆抗体（mAb）但不影响SCF信号或KIT功能。利用腺嘌呤碱基编辑（ABE）或先导编辑（PE）在HSPC中实现多重编辑，同时破坏BCL11A红系增强子（+58和+55位点）以诱导胎儿血红蛋白（HbF）表达，用于治疗血红蛋白病。该研究发表在《Nature》。

主要关键技术方法：研究人员利用腺嘌呤碱基编辑（ABE）和先导编辑（PE）技术，在健康供体动员外周血CD34⁺ HSPC中引入KIT突变及BCL11A增强子破坏；通过慢病毒条形码文库（含28碱基简并序列）标记细胞，进行克隆追踪；采用NBSGW小鼠异种移植模型评估体内选择；利用CHANGE-seq、rhAmpSeq和UDiTaS进行基因组安全性分析；流式细胞术及高效液相色谱（HPLC）评估HbF诱导。

**1. 多重编辑KIT与BCL11A**：通过ABE在HSPC中实现KIT^H378R、BCL11A+58和+55位点高效编辑（分别78%、72%、74%），编辑后HSPC表型组成不变，红系分化后HbF显著升高，且与破坏的WGATAR基序数量相关。单细胞基因型分析显示高比例双等位基因共编辑（KIT和BCL11A）。体外培养中，Fab-79D抗体选择性抑制未编辑细胞，而KIT^H378R编辑细胞增殖不受影响，且共富集BCL11A编辑。

**2. KIT^H378R碱基编辑实现体内共选择**：在NBSGW小鼠中移植KIT^H378R+BCL11A编辑HSPC与对照，分别用慢病毒标记mtBFP和mNG。接受Fab-79D处理后，延长间隔方案（q5d或q10d）显著富集mtBFP⁺（KIT^H378R）细胞，尤其在髓系（如肥大细胞、粒细胞、单核细胞）中达到近完全选择，且与KIT表达水平相关。骨髓HSPC保留多系分化潜能，分子分析确认KIT和BCL11A编辑显著富集，并伴有HbF去抑制。

**3. 体内选择不影响克隆性**：通过慢病毒条形码追踪，分析骨髓中CD33⁺髓系、CD19⁺淋巴系和Lin^?CD34⁺祖细胞。未编辑（mNG⁺）HSPC的克隆多样性（Shannon指数）在抗体处理组中下降，而编辑（mtBFP⁺）HSPC的克隆数目和多样性未减，表明表位编辑保护了HSPC免受mAb介导的耗竭，且未诱导克隆选择或扩增。

**4. 表位编辑实现HSPC移植**：在预先植入未编辑HSPC的小鼠中，给予Fab-79D条件处理（8次剂量），并在第4-5次剂量间移植KIT^H378R编辑HSPC。结果显示，预植入的未编辑造血被显著耗竭（-72.2%），而KIT^H378R编辑细胞成功植入并逆转了荧光组成（从90% mNG⁺转为95% mNG^?），证明表位编辑可在mAb药代动力学不受限的窗口期内实现移植。

**5. 高亲和力SR-1 mAb的表位定位**：SR-1（briquilimab类似物）以更高亲和力（比Fab-79D低10倍以上）结合KIT，抑制HSPC增殖。通过人-鼠嵌合KIT构建体筛选，定位SR-1表位为ECD2的118-127位氨基酸。进一步利用简并密码子文库筛选，鉴定出D121和S123位点突变可破坏SR-1结合，且不影响SCF亲和力或KIT功能。

**6. S123P赋予对SR-1的部分抗性**：通过ABE在HSPC中引入KIT^S123P突变（效率约75%）。体外竞争实验中，SR-1处理可富集KIT^S123P编辑细胞，但高浓度时保护减弱。体内实验中，SR-1剂量依赖性地富集KIT^S123P编辑造血，但高剂量下绝对人细胞数减少，提示不完全保护。

**7. KIT^D121L防止SR-1介导的耗竭**：由于ABE无法引入D121L，研究人员采用先导编辑（PE）和PE7配置，优化后实现HSPC中KIT^D121L（约55%）和BCL11A+58（约75%）的双重编辑。PE3设计产生更多双等位基因编辑，HbF诱导更强。体外实验表明，KIT^D121L编辑细胞在极高SR-1浓度下仍保持生长，CFU计数显著高于未编辑对照。单克隆分析显示，SR-1处理选择性富集双等位基因KIT^D121L编辑。

**8. 基因组安全性**：通过NGS、CHANGE-seq、rhAmpSeq和UDiTaS评估，KIT表位编辑（H378R和D121L）未检测到脱靶碱基替换或显著插入缺失，且PE2产生的indel极低（<0.1%）。但BCL11A+58靶向在PE3中产生较高indel（44.8%），且通过ddPCR检测到低频率组间易位（0.16/千二倍体基因组）。结论：当前设计需优化，如采用PAM限制性Cas变体或PE2系统以降低风险。

**9. KIT^D121L细胞在体内通过SR-1富集**：移植KIT^D121L+BCL11A+58双编辑HSPC至NBSGW小鼠，6周后给予6次SR-1注射（0.012-1.5 mg）。SR-1剂量依赖性地消除野生型KIT细胞，仅保留SR-1阴性（双等位基因编辑）细胞，且骨髓中KIT^D121L编辑效率显著富集。与S123P相比，D121L在更高剂量下仍能保护编辑细胞，提高了治疗指数。

**10. KIT^D121L实现高效HSCT**：在预先植入未编辑HSPC的小鼠中，给予2次SR-1（0.25或0.5 mg）后12小时内移植KIT^D121L+BCL11A+58编辑HSPC。结果显示，SR-1条件处理几乎完全清除预植入的未编辑细胞（mNG⁺），并实现完全由mtBFP⁺编辑细胞组成的多系重建。相比之下，仅BCL11A编辑的HSPC无法植入。克隆分析显示，KIT^D121L编辑组保留了克隆多样性，而SR-1条件下未编辑HSPC的条形码数量和Shannon指数显著下降。二次移植实验证实，KIT^D121L编辑HSPC具有长期重建能力，且仅双等位基因编辑细胞可维持。

**11. 免疫选择增强SCD基因治疗**：从镰状细胞病（SCD）患者来源的CD34⁺ HSPC中进行多重编辑（KIT^H378R或KIT^D121L+BCL11A）。在低嵌合率模型中，抗体暴露显著富集KIT和BCL11A编辑（碱基编辑：KIT 83.6%，BCL11A+58 76.5%，+55 84.5%；先导编辑：KIT 60.8%，BCL11A+58 59.75%），并导致HbF升高、HbS降低，达到临床相关阈值。

**讨论与结论**：表位编辑通过解耦干细胞条件处理与毒性，克服了基因和细胞疗法广泛部署的关键障碍。研究结论指出，表位编辑具有范式转变潜力，可实现下一代HSCT：通过将治疗性编辑与表位编辑在体内共递送，利用免疫介导的选择富集基因组修饰细胞，使患者能在无长期再生障碍、不孕或继发恶性肿瘤风险下接受挽救性干细胞治疗，且住院需求极小或无需住院。