基于深度学习的FT-IR光谱技术，对治疗用植物粉中的叶绿素及抗氧化活性进行无损定量分析

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Deep learning–driven non-destructive quantification of chlorophyll and antioxidant activity in therapeutic plant powders using FT-IR spectroscopy

　　

Rahul Joshi|Sushma Kholiya|Himanshu Pandey|Mahipal Singh|Ameeta Tewari|Jinsu Lim|Sang Un Park|Byoung-Kwan Cho

韩国大田市儒城区大学路99号，忠南国立大学智慧农业系统机械工程系，邮编34134

摘要

药用植物是生物活性植物化学物质和色素的丰富来源，这些物质具有重要的生物学功能，包括抗氧化防御作用。叶绿素作为主要的光合作用色素，与植物的生理状态密切相关，同时也影响着植物组织的抗氧化能力。本研究提出了一种快速且无损的方法，利用傅里叶变换红外光谱技术结合化学计量学和深度学习模型，同时量化药用植物粉末中的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量以及总抗氧化活性。研究收集了10种药用植物的FT-IR光谱，并通过偏最小二乘回归法和一维卷积神经网络对其进行分析。对于叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素，1D-CNN模型的决定系数分别为0.997、0.998和0.9997，预测的均方根误差分别为0.13、0.04和0.15微克/毫升。而对于通过DPPH、ABTS和RPA试验测定的抗氧化活性，1D-CNN模型的决定系数分别为0.994、0.992和0.997，均方根误差分别为1.52%、1.22%和0.01%，同时其性能与偏差比很高，表明这些模型具有很强的预测能力和稳定性。在所有测试中，深度学习模型的表现都优于传统的PLSR模型。这些研究结果表明，将FT-IR光谱技术与深度学习相结合，可作为一种快速、准确且无损的方法，用于评估药用植物粉末的关键质量指标。该方法为传统的高劳动强度和高试剂消耗的检测方法提供了有力的替代方案，有助于在草药产业中实现高效的质量控制和高通量筛选。

引言

由于具有多种药用特性，药用植物长期以来一直被用于人类医疗保健。众多研究已证明它们在治疗肾结石和尿路结石[1]、糖尿病[2]、高血压和肾脏疾病[3]、白带异常[4]、胃肠道疾病[5]以及风湿病[6]等方面具有显著效果。这些植物以原始形式或种子、叶子等加工形式被食用，其中含有大量的初级和次级代谢物，如萜类化合物、蛋白质、碳水化合物、酚类物质和黄酮类化合物[7]，这些物质既有助于植物的生长，也有助于其防御机制的建立[8]。

叶绿素是最重要的生物活性化合物之一，也是药用植物的重要质量指标。它决定了叶子的绿色，同时在光合作用中起着关键作用，能够将光能转化为化学能[9]。叶绿素含量与植物的生理状态、生产力以及农业产量密切相关[10]、[11]、[12]。叶绿素a和叶绿素b这两种主要形式对植物的生长和整体健康至关重要[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。由于环境因素可能会改变叶绿素浓度，进而影响光合作用效率[18]，因此准确测定总叶绿素含量对于评估植物质量极为重要。目前用于测定总叶绿素含量的传统方法，如使用丙酮或二甲基亚砜等溶剂进行分光光度分析[19]、高效液相色谱法[20]以及薄层色谱法[21]，通常都具有破坏性，且需要大量人力和时间，难以满足快速实时分析的需求。

除了在光合作用中的作用外，叶绿素还具有抗氧化特性，这也是药用植物具备抗氧化功能的原因之一[22]、[23]、[24]。抗氧化活性通常通过DPPH、ABTS、铁还原抗氧化力试验以及Folin–Ciocalteu试验等方法来评估[25]、[26]、[27]、[28]。然而，这些传统方法往往需要复杂的样品预处理过程，耗费大量试剂，且结果易出现波动[29]。因此，亟需一种快速、可靠且无损的分析方法，能够同时测定叶绿素含量和抗氧化活性。

光谱技术已成为快速化学分析的有效替代手段。其中，傅里叶变换近红外光谱和拉曼光谱能够实现快速、无损的测量，且样品预处理要求较低，已被广泛应用于食品科学[30]、[31]、[32]、科学领域[33]、[34]、[35]、[36]及相关学科中。不过，FT-NIR光谱往往存在由泛频和组合振动产生的宽而重叠的吸收带，这会给光谱解读带来困难。同样，拉曼光谱也可能受到荧光干扰的影响，而且在高激光功率作用下还存在样品发热或热降解的风险。相比之下，傅里叶变换红外光谱能够分析分子键的基本振动模式，是一种稳定且无损的分析方法，能够克服FT-NIR和拉曼光谱的诸多局限性。此外，FT-IR光谱中特征明确的官能团和指纹区域，有助于精确识别和表征植物材料中的化学成分。

除了在植物科学领域的应用之外，材料科学领域的最新进展也展示了如何将光谱技术、荧光技术和生物活性相结合，从而推动分析研究的进步。例如，纳米磁铁矿/羊毛复合材料被设计用于高效吸附并借助光芬顿反应分解环丙沙星，这类环保型生物聚合物-纳米粒子复合材料在环境修复方面具有广泛应用前景[37]。经6-氨基香豆素共价修饰的聚己内酯复合材料则具有更高的结晶度、更强的荧光性能以及广谱抗菌活性，因此可作为一种多功能生物材料用于组织工程领域[38]。基于咔唑结构的供体-受体色基则具有可调节的光物理特性和抗菌效果，实现了光电功能与生物活性的结合[39]。这些研究都体现了向兼具结构特征、光学性质和生物活性的多功能系统发展的趋势。然而，在药用植物粉末的研究中，仍然迫切需要开发出定制化的策略，结合先进的化学计量学模型，以实现快速、精准的预测分析。

由于仅凭原始的FT-IR光谱往往无法构建准确的预测模型，因此通常需要通过多元分析来提取有意义的信息。不过，这些化学计量学方法往往依赖于多种预处理步骤，且在处理噪声较大、维度较高的数据时往往效果不佳。近年来，深度学习方法，尤其是卷积神经网络，在光谱数据分析领域展现出巨大潜力，因为它能够实现自动特征提取，并提高预测精度[40]。一维卷积神经网络尤其适合用于光谱数据分析，因为它们能够有效捕捉波数区域内的局部特征，从而减少手动特征工程的需要[41]。为了构建更可靠的预测分析模型，有必要同时评估机器学习和深度学习方法的适用性。

基于此，本研究主要探讨了傅里叶变换红外光谱作为一种快速、无损的方法，用于定量测定药用植物粉末中的关键质量参数，即叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量以及抗氧化活性的可行性。为进一步提升预测的准确性和稳定性，本研究还开发了两种建模方法，并对它们进行了比较：偏最小二乘回归法和一维卷积神经网络。

章节摘录

样品

本研究从印度北阿坎德邦的不同地区采集了10种不同的药用植物，用于光谱分析。各物种的详细信息见表T1。为消除光谱采集过程中的水分干扰，所采集的植物材料经过彻底清洗后，在70℃下烘干，然后磨成细粉。这些粉末样品随后被用于分光光度分析和振动光谱分析，以便测定其中的叶绿素含量。

光谱解读

图4显示了使用实验室光谱仪获得的原始FT-IR光谱。由于这些光谱中存在重叠的吸收带，以及由环境噪声、仪器漂移和光散射等因素导致的失真，因此需要对光谱进行预处理，以降低这些因素对预测和分类性能的负面影响。为确定最合适的预处理方法，研究人员评估了多种常用的预处理技术，其中包括乘法散射校正技术。

结论

本研究证明了傅里叶变换红外光谱作为一种快速、无损的技术，在测定10种药用植物粉末中的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量以及抗氧化活性方面的应用潜力。所收集的FT-IR光谱覆盖了650–3600厘米负一次方的波长范围，其中叶绿素的特征吸收带分别出现在1720–1755厘米负一次方处（C=O伸缩振动），1545–1570厘米负一次方处（N-H弯曲振动），以及3200–3500厘米负一次方处（O-H伸缩振动）。

CRediT作者贡献说明

Rahul Joshi：概念设计、研究方法、初稿撰写。Sushma Kholiya：研究方法、概念设计。Himanshu Pandey：研究方法、概念设计。Mahipal Singh：研究方法、概念设计。Ameeta Tewari：研究方法、概念设计。Jinsu Lim：概念设计、研究方法。Sang Un Park：概念设计、研究方法。Byoung-Kwan Cho：概念设计、研究方法、正式分析、审稿与编辑、项目管理、资源协调、研究指导。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了韩国食品、农业和林业技术规划与评估研究院（IPET）以及韩国智慧农场研发基金会（KosFarm）在“智慧农场创新技术发展计划”下的支持，该计划由韩国农业、食品和农村事务部（MAFRA）、韩国科学和信息通信技术部（MSIT）以及农村发展厅（RDA）共同资助，项目编号为2540000915。作者同时感谢库马恩大学哈尔德瓦尼分校M.B.G.P.G学院的化学系给予的支持。