《International Journal of Molecular Sciences》：MicroRNA Expression Profiles as Biomarkers of Response to Disease-Modifying Therapies in Multiple Sclerosis: A Systematic Review
尽管微小RNA（miRNA）是多发性硬化症（MS）研究中的一个活跃领域，并已被提出作为治疗反应的潜在生物标志物，但相关证据仍然难以解释。本系统综述旨在检查miRNA表达与成人MS患者对疾病修饰疗法（DMT）反应之间的关系。研究人员系统检索了PubMed/MEDLINE和Web of Science数据库，从建库至2026年2月11日。根据2020年PRISMA指南，对15项研究进行了叙述性综合，这些研究比较了应答者和非应答者之间的miRNA表达，或评估了DMT启动后miRNA表达的变化，并按治疗组和结局进行分组。在考虑了研究设计、治疗反应定义和miRNA分析方法后，在芬戈莫德治疗患者中的miR-548a-3p以及在富马酸二甲酯（DMF）治疗患者中的miR-223-3p、miR-23a/b-3p和miR-27a/b-3p表现为最有前景的miRNA；然而，每个miRNA均仅在单一研究中被评估，且尚未在独立外部队列中得到验证。但值得注意的是，它们已在临床相关环境中得到评估：miR-548a-3p与无疾病活动证据-3（NEDA-3）状态及基于受试者工作特征（ROC）的区分相关，而DMF相关的miRNA则通过基线表达水平和早期倍数变化分析进行评估。尽管miR-23a-3p、miR-26a-5p、miR-146a-5p、miR-155、miR-34a-5p、miR-223-3p、miR-660-5p和miR-326已在多项研究中被报道，但大多数是在不同的DMT或结局背景下进行研究的。因此，现有将miRNA表达水平与治疗反应相关联的文献提供了有价值但有限且异质性的证据。因此，miRNA目前应被视为探索性生物标志物，在应用于临床实践之前需要进一步的独立验证。
1. Introduction
多发性硬化症（MS）是一种慢性、异质性的中枢神经系统（CNS）免疫介导疾病，是年轻成人长期神经功能障碍的主要原因之一，严重影响生活质量。其发病机制涉及遗传与环境因素的复杂相互作用，导致先天性和适应性免疫系统的失调。在外周，B细胞辅助T细胞分化为不同亚群，其中辅助性T细胞1（Th1）和辅助性T细胞17（Th17）在MS发病中最为相关，它们促进血脑屏障（BBB）破坏并浸润CNS，引发复杂的免疫反应，包括小胶质细胞和星形胶质细胞，导致脱髓鞘及轴突和神经元损伤。胶质细胞通过形成滤泡样结构将病理过程分隔，支持慢性免疫激活。对潜在致病机制的深入理解促进了疾病修饰疗法（DMT）的发展，旨在减少炎症活动、降低复发率并延缓疾病进展。然而，治疗反应的变异性是临床决策中的主要挑战，凸显了对可靠工具评估、监测和预测治疗反应的需求。尽管复发率、残疾进展和磁共振成像（MRI）上的病灶活动是常用的临床和放射学评估指标，但它们对MS潜在分子和免疫机制的了解有限。神经丝蛋白（NfL）反映轴突损伤，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）主要由CNS中成熟星形胶质细胞表达，已成为MS进展的潜在血清和脑脊液（CSF）生物标志物，但缺乏疾病特异性。微小RNA（miRNA）是小的非编码核糖核酸（RNA）分子，通过结合特定信使RNA在转录后阶段调节基因表达，导致其降解或抑制翻译。与NfL和GFAP不同，miRNA似乎参与MS发病的早期阶段，调节T细胞、B细胞和胶质细胞的分化、成熟和功能。miRNA可从多种体液中分离，包括血浆、CSF以及外泌体，后者可指示其细胞来源。多项研究显示，miRNA在MS患者中表达失调，且受不同DMT影响，提示miRNA可作为MS诊断、治疗反应评估、进展监测以及潜在治疗靶点的生物标志物。尽管miRNA在MS中的研究日益增多，但样本量小、研究miRNA、研究设计和患者人群的异质性阻碍了临床适用生物标志物的验证。因此，本系统综述旨在评估成人MS患者中miRNA表达与DMT反应之间关系的现有证据，研究应答者与非应答者之间的差异以及治疗前后纵向变化。
2. Materials and Methods
2.1. Objectives
本研究旨在系统综述血液和CSF来源的miRNA表达谱（包括外泌体miRNA）作为成人MS患者对DMT反应的生物标志物的证据，并评估与治疗反应相关的miRNA表达在治疗启动后的纵向变化。
2.2. Protocol Registration
本系统综述按照2020年PRISMA指南进行和报告，其方案已在国际系统综述注册平台PROSPERO预注册（注册号：CRD420261305887）。
2.3. Eligibility Criteria
根据PICOS框架定义纳入标准：人群（Population）为18岁及以上、根据McDonald标准或其他标准诊断为复发缓解型MS（RRMS）的成人，混合表型仅当RRMS数据可单独获取或多数患者为RRMS时纳入；干预（Intervention）为经批准的DMT；比较（Comparison）为治疗应答者与非应答者之间miRNA表达的比较，或DMT启动后miRNA表达的变化（需与临床或放射学治疗反应相关）；结局（Outcome）为miRNA表达水平与治疗反应（基于临床和/或放射学标准，如复发率、残疾进展或MRI病灶活动）的关联，以及治疗反应相关的miRNA表达纵向变化；研究设计（Study Design）为观察性研究（前瞻性或回顾性），包括纵向和横断面设计，排除体外、动物、病例报告、综述、社论和无全文会议摘要；样本类型（Sample Type）包括血浆、血清、全血、外周血单核细胞（PBMC）、外周血白细胞（PBL）、外泌体或CSF；语言与出版日期仅限英文，无日期限制。
2.4. Study Identification
系统检索PubMed/MEDLINE和Web of Science数据库，从建库至2026年2月11日，结合受控词汇（MeSH）和自由文本词，涵盖MS、miRNA和多种DMT（如干扰素-β [IFN-β]、醋酸格拉替雷 [GA]、富马酸二甲酯 [DMF]、特立氟胺、芬戈莫德、西波尼莫德、奥扎尼莫德、珀奈莫德、鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂、那他珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法妥木单抗、克拉屈滨、阿仑单抗、乌布利妥昔单抗、米托蒽醌、地瑞昔姆富马酸）。通过Web of Science进行前向和后向引文追踪，并补充Google Scholar检索（前100条结果）以识别可能遗漏的研究。
2.5. Study Selection
文献筛选分两阶段进行：首先将检索记录导入EndNote去重，再导入Rayyan平台，由两名独立评审员根据PICOS标准筛选标题和摘要；随后独立评估全文，通过讨论达成共识。纳入标准为评估miRNA表达与成人RRMS患者接受经批准DMT后治疗反应之间关联的研究，治疗反应基于临床或放射学结局或复合结局（如NEDA-3：无临床复发、无确认残疾进展 [CDP]、无MRI新发/扩大病灶）。排除未使用明确临床或放射学标准评估治疗反应，或仅分析miRNA与其他预测生物标志物关系而未评估临床/放射学反应的研究。
2.6. Data Extraction
使用预定义数据提取表提取信息，包括研究特征（第一作者、发表年份、国家、研究设计）、参与者特征（各时间点患者数、MS表型、诊断标准、平均年龄、平均扩展残疾状态量表 [EDSS] 评分、MS病程、性别分布）、DMT类型、治疗持续时间、既往治疗情况、洗脱期（如有）、随访时间、治疗反应定义、样本类型、miRNA分析方法、RNA提取试剂盒、标准化策略、分析的具体miRNA、miRNA表达变化方向（上调或下调）、统计显著性、统计检验以及miRNA表达水平与治疗反应之间的关联。
2.7. Risk of Bias Assessment
采用队列版纽卡斯尔-渥太华量表（NOS）评估前瞻性纵向研究，病例对照版NOS评估应答者与非应答者比较研究，JBI 2017分析性横断面研究关键评估清单评估横断面研究。在病例对照研究中，非应答者/“差”应答者被视为病例，应答者/“好”应答者被视为对照。健康对照组或未治疗MS组作为辅助比较组，不用于评估治疗反应偏倚。在队列版NOS中，“非暴露队列的选择”项目仅当研究包含独立暴露队列时才评分；应答者/非应答者分组视为结局分层而非暴露状态。在队列版NOS中，“暴露”项目指DMT治疗，而在JBI清单中，“暴露”指生物标志物（miRNA）表达水平。
2.8. Data Synthesis
由于研究设计、治疗反应定义、分析miRNA、miRNA分析方法和生物样本类型存在显著异质性，无法进行定量荟萃分析，因此采用叙述性综合。首先以表格形式描述性总结研究特征和主要发现，然后按评估的DMT分组，对主要和次要结局进行叙述性综合。尽可能检查在多项研究中被调查的miRNA在方向和强度上的一致性，并定性解释结果，特别注意方法学异质性、样本类型、分析平台和结局定义对研究间比较的影响。
3. Results
3.1. Study Selection
文献检索共识别213条记录，去重后剩余123条进行标题和摘要筛选，其中31篇进入全文审查，最终15项研究符合纳入标准并纳入定性综合。前向和后向引文追踪未发现额外合格研究，Google Scholar补充检索也未识别其他合格研究。
3.2. Characteristics of the Included Studies
3.2.1. Study Design
15项研究中，7项（46.7%）采用前瞻性纵向观察设计，在不同时间点获取miRNA样本并评估患者，随访期6个月至5年，主要评估治疗启动后miRNA表达的纵向变化（应答者组内基线至随访点，或应答者与非应答者间比较）。3项（20.0%）采用观察性病例对照设计，在随访6个月至2年后回顾性定义治疗反应，主要比较应答者与非应答者间miRNA表达，部分研究还比较MS患者与健康对照。5项（33.3%）采用横断面设计，在随访1至2年后回顾性定义治疗反应，在单一时间点（随访结束时）获取miRNA样本并比较应答者与非应答者。这些设计捕捉了miRNA表达与治疗反应的不同时间关系，影响候选miRNA作为预测性、纵向监测性或反映治疗反应的生物标志物的解释。
3.2.2. Study Population and DMT Characteristics
15项研究发表于2014至2025年，研究对象为成人RRMS患者，一项研究也包含SPMS患者但多数为RRMS。11项（73.3%）使用McDonald诊断标准，2项使用Poser标准，2项未报告。6项（40.0%）纳入初治患者，7项（46.7%）仅纳入既往接受过特定DMT的患者，2项未报告；仅一项研究报告了洗脱期。IFN-β是最常研究的DMT（n=7），其次是芬戈莫德（n=4）、DMF（n=2）、GA（n=1）；两项研究在同一队列中评估了多种DMT。大多数研究样本量较小，从11例至105例不等。总体而言，现有证据集中于有限数量的DMT，miRNA作为治疗反应生物标志物的结论应在其特定DMT背景下解释。
3.2.3. Definition of Therapeutic Response
治疗反应定义在15项研究中各不相同：3项基于NEDA-3，1项还使用了NEDA-4（NEDA-3加无认知进展）和NEDA-5（NEDA-4加脑萎缩≤0.4%）；1项根据MRI病灶活动区分“稳定应答者”与“阳性应答者”；1项仅基于EDSS进展；10项使用EDSS进展、复发发生和MRI病灶活动的组合。总体而言，定义涵盖了疾病控制的不同方面，miRNA结果在总体治疗益处和特定疾病活动成分两种背景下报告。
3.2.4. Sample Types and Analytical Methods
miRNA从血清/血浆、PBMC/PBL、外周全血和外泌体等多种生物样本中分离。9项（60.0%）在单一时间点采集样本，6项（40.0%）在基线和预定时间间隔采集。10项（66.7%）使用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）方法，4项（26.7%）使用高通量方法（如小RNA测序），3项（20.0%）使用广泛分析方法后对选定miRNA进行RT-qPCR验证。RNA提取试剂盒、标准化方法（内源性对照、外源性对照、全局均值归一化或测序特异性归一化）在不同研究间存在差异。这些差异应被考虑，因为循环、细胞和外泌体来源的miRNA可能提供不同的生物学信息。
3.3. Primary Outcome: Association Between miRNA Expression and Treatment Response
3.3.1. Overview of the Findings
9项（60.0%）研究满足主要结局标准，通过比较应答者与非应答者评估miRNA表达与治疗反应的关联。大多数在单一治疗后时间点测量miRNA，仅两项包括基线采样。一项研究还评估了治疗诱导的倍数变化。两项采用替代设计（基线预测结局、横断面比较治疗与初治患者）的研究也被纳入。在主要结局分析中，miR-23a-3p、miR-146a-5p、miR-223-3p、miR-660-5p和miR-326在多项研究中被报告，但均在不同DMT背景下，且在同一治疗组内未得到一致重复。因此，证据按治疗组合成。
3.3.2. Interferon-Based Therapies
4项研究评估IFN-β与主要结局的关联，均为横断面设计，在治疗1年后通过RT-qPCR定量miRNA，比较应答者与非应答者。miR-29b-3p、miR-29-5p和miR-185-5p在应答者中显著下调，miR-504显著上调，但一项研究未发现显著差异。此外，一项研究报告治疗患者中miR-22-3p和miR-660-5p较初治患者显著上调，且在应答者中观察到调节。这些miRNA均仅由单一研究支持，未在独立IFN-β队列中重复。
3.3.3. Fingolimod
3项研究评估芬戈莫德治疗反应与miRNA的关联。两项病例对照研究由同一研究组进行，可能包含重叠队列，在治疗后单一时间点检测miRNA，发现应答者与非应答者间无显著差异，但应答者与健康对照间存在差异（如miR-381-3p、miR-655-3p等）。一项前瞻性纵向研究（含发现和验证队列）在治疗后6-12个月检测血清miRNA，发现miR-548a-3p在NEDA-3组中显著升高，且具有良好的预测性能（AUC=0.882）。因此，miR-548a-3p是唯一直接与芬戈莫德反应相关并在独立队列中验证的miRNA。
3.3.4. Other DMTs
一项研究评估DMF，发现miR-223-3p和miR-23a-3p在治疗3和6个月后下调，其基线水平和倍数变化可区分良好与不良应答者；miR-23b-3p、miR-27a-3p和miR-27b-3p的基线水平和倍数变化也可区分应答者。一项研究评估多种DMT（纳他珠单抗、IFN、特立氟胺、DMF、奥瑞珠单抗、西波尼莫德、克拉屈滨），发现整合miRNA表达与外泌体标志物的组合模型对NEDA-3、NEDA-4、NEDA-5状态具有良好的区分能力，但不同DMT合并分析，更能反映治疗结局分类而非特定DMT反应。一项前瞻性纵向研究评估基线miRNA与临床结局的关联，发现miR-126-3p和miR-146a-5p与2年CDP显著相关，miR-9-5p与EDSS进展相关，miR-138-5p与NEDA-3相关。
3.4. Secondary Outcome: Longitudinal Changes in miRNA Expression After Treatment Initiation in Relation to Treatment Response
3.4.1. Overview of the Findings
4项研究评估治疗启动后miRNA表达的纵向变化与治疗反应的关系。发现可分为三类：在应答者中主要变化的miRNA（miR-26a-5p、miR-130b-3p、miR-654-5p、miR-487b-3p、miR-150-5p、miR-548e-3p）；治疗启动后早期调节但未直接比较应答者与非应答者的miRNA（miR-494、miR-100-5p）；水平与后期残疾进展相关的miRNA（miR-125a-5p、miR-146a-5p）。这些研究提示某些miRNA表达可受DMT启动影响，且与反应状态或残疾结局相关，但未提供其能在临床明显前预测治疗反应的强证据。
3.4.2. IFN-Based Therapies
一项研究在初治患者中检测基线及治疗3和6个月后的miRNA，发现miR-26a-5p在应答者中于3个月时上调，而非应答者中无变化。另一项研究在既往治疗患者中检测IFN-β给药前和48小时后miRNA，发现miR-494和miR-100-5p在“良好应答者”中较未治疗患者表达更高。总体而言，IFN-β的次要结局证据主要支持miR-26a-5p在应答者中的纵向变化，以及miR-494和miR-100-5p在IFN-β启动后的早期变化，但缺乏这些变化与治疗反应状态直接关联的证据。
3.4.3. Other DMTs
一项研究评估芬戈莫德，发现6个月时在MRI反应良好的患者中miR-130b-3p、miR-654-5p和miR-487b-3p升高，miR-150-5p和miR-548e-3p降低。一项研究评估DMF，发现miR-125a-5p和miR-146a-5p在治疗4个月后下调，并与残疾进展相关。
3.5. Recurrently Reported miRNAs and Findings from ROC Analysis
miR-23a-3p在多项研究中与治疗反应相关：在DMF治疗中基线和倍数变化可区分应答者；在IFN-β治疗中较初治患者下调，且在不同应答组间差异表达；与NEDA-5状态相关。miR-26a-5p是唯一在两项IFN-β研究中被评估的miRNA，结果不一致。miR-155在不同研究中结果不一致（IFN-β无变化，DMF后下降）。miR-34a-5p在芬戈莫德应答者中较健康对照降低，但在DMF中无显著纵向变化。miR-146a-5p在DMF后下降，在IFN-β治疗患者中较初治患者低，且与残疾进展相关。miR-223-3p在DMF后下降，基线水平和倍数变化可区分应答者，在IFN-β中较初治患者下调，但在一项研究中与治疗反应无显著关联。miR-660-5p在IFN-β后升高（在应答者中观察到变化），在严重疾病活动患者中表达较低。miR-326在IFN-β应答者中非显著降低，在达到NEDA-3/4/5的患者中表达降低。ROC分析显示，IFN-β研究中miR-185-5p和miR-504的AUC较低（0.663和0.629），芬戈莫德中miR-548a-3p的AUC为0.882，多种DMT组合模型中miR-98-5p等与微囊泡组合的AUC很高（0.86-1.00），而另一项研究的多项miRNA均无显著区分能力。总体而言，这些发现需要进一步验证，miR-23a-3p、miR-26a-5p、miR-146a-5p、miR-155、miR-34a-5p、miR-223-3p、miR-660-5p和miR-326在多项研究中被报告，但大多涉及不同DMT、结局定义或比较组。
3.6. Risk of Bias of the Included Studies
大多数研究（13/15，86.7%）被评定为中等偏倚风险，2项（13.3%）为低偏倚风险。NOS评估的研究在选择和结局域得分较高，但对混杂因素调整不足和组间可比性有限是主要潜在偏倚来源。JBI评估的研究在纳入标准、参与者描述、统计分析、暴露测量和结局方面报告充分，但混杂控制问题仍然存在。
4. Discussion
4.1. Principal Findings
现有数据支持miRNA在评估MS患者特定DMT反应中的潜在作用，但尚不足以应用于临床。最相关的结果包括：芬戈莫德治疗患者中的miR-548a-3p，以及DMF治疗患者中的miR-223-3p、miR-23a/b-3p和miR-27a/b-3p，这些来自方法学更稳健的研究。IFN-β相关miRNA（如miR-29b-3p、miR-29-5p、miR-185-5p、miR-504、miR-26a-5p）的证据更初步，仅在单一研究中发现，且ROC分析中区分性能有限。从临床角度看，miRNA可能帮助识别对给定DMT更可能或更不可能反应的患者，从而在炎症活动或残疾进展临床明显前指导治疗调整。生物学上，多数miRNA参与免疫和炎症调节，但尚需确定DMT是否直接改变miRNA表达，还是变化仅反映炎症活动减少，或miRNA本身驱动抗炎效应。
4.2. Heterogeneity of the Included Studies
研究间结果不一致的主要限制因素是方法学方面的异质性：研究设计多样（纵向、横断面、病例对照），包括初治和既往治疗人群；治疗反应定义差异大（临床参数、MRI病灶活动、复合结局如NEDA），限制结果可比性；miRNA来源不同（体液、PBMC、外泌体），每种样本类型具有独特的生物学特性；miRNA分析平台和标准化策略不同（RT-qPCR、测序、不同内参和归一化方法）；采样时间点和随访时间差异大。这些因素共同导致结果难以直接比较。
4.3. Methodological Limitations of the Included Studies
常见局限性包括：样本量小，限制统计效能和普适性，增加假阳性风险；混杂因素（如饮食、运动、年龄、吸烟）难以调整，许多研究仅进行未调整比较；探索性研究中多重检验校正不充分，增加假阳性；缺乏独立验证，仅一项研究包含发现和验证队列；其他局限性包括治疗变更、随访样本缺失、分析总外泌体而非特定来源外泌体等。
4.4. Recurrently Reported miRNAs and Their Biological Relevance
miR-23a在实验模型中促进髓鞘形成，在MS单核细胞中过表达，多项研究提示其可作为治疗反应生物标志物。miR-155具有促炎作用，在MS活动性病灶中高表达，DMF可降低其表达，但临床数据有限。miR-34a在活动性病灶中上调，与炎症活动相关，可能区分复发与缓解期。miR-660在MS中研究较少，在未治疗患者中表达较低，治疗后升高。miR-326与疾病严重程度相关，在活动性病灶中上调，不同DMT对其影响方向不同。miR-26a-5p参与谷氨酸转运和
