恶性胸膜间皮瘤的聚糖指纹

《International Journal of Molecular Sciences》：Glycan Fingerprint of Malignant Pleural Mesothelioma

　　

恶性胸膜间皮瘤（malignant pleural mesothelioma, MPM）是一种与石棉暴露相关的侵袭性胸膜肿瘤。MPM预后不良常源于晚期诊断，原因包括非特异性临床表现、与胸膜病变（如炎性改变、转移性腺癌）的相似性以及当前诊断方法的局限性。研究人员采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared, FTIR）联合卷积神经网络（convolutional neural networks, CNNs）分析了来自MPM、转移性腺癌、胸膜炎和正常（健康）胸膜患者的福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）胸膜组织样本。使用超高效液相色谱（ultra-high-performance liquid chromatography, UPLC）和质谱（mass spectrometry, MS）对FFPE正常胸膜和MPM进行了聚糖分析。研究人员的FTIR光谱分析揭示了MPM的一个强光谱指纹，该指纹在典型对应于C-O和C-C伸缩以及CH₂和C-OH基团变形振动的区域尤为明显，所有这些均出现在碳水化合物中。研究人员通过使用UPLC的靶向糖组学方法对这些发现进行了正交验证，证实MPM的N-聚糖组（N-glycome）展现出区别于正常胸膜组织的独特指纹。通过利用MS鉴定差异表达的N-聚糖峰的确切结构，研究人员还鉴定了两种高甘露糖N-聚糖结构，这些结构显示出MPM特异性生物标志物的潜力，需在未来的研究中进一步检验。

恶性胸膜间皮瘤（MPM）是一种与石棉暴露密切相关的侵袭性胸膜肿瘤，其诊断面临重大挑战：临床表现非特异、易与胸膜炎及转移性腺癌混淆，且现有生物标志物（如间皮素）灵敏度仅约30%–50%。为改善MPM的早期准确诊断，研究人员开展本项研究。研究人员采用傅里叶变换红外（FTIR）光谱联合卷积神经网络（CNN）分析福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）胸膜组织（样本来自萨格勒布大学医学院病理科，含MPM、转移性腺癌、胸膜炎及正常胸膜），发现糖类吸收区域（900–1200 cm^-1）具有最强鉴别力；进而通过正交的靶向糖组学方法——超高效液相色谱（UPLC）和质谱（MS）——对比MPM与正常胸膜的N-聚糖谱，鉴定出两组在49个N-聚糖峰中有16个差异峰，其中高甘露糖结构（如H5N2、H7N2）在MPM中显著降低，有别于其他肺癌类型，提示其作为MPM特异性生物标志物的潜力。论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。该研究首次将FTIR光谱与糖组学分析结合，揭示了MPM的独特N-聚糖指纹，为基于光谱的快速诊断和糖类生物标志物开发提供了分子生物学依据。

研究人员为开展研究主要采用了以下关键技术方法：
（1）FTIR光谱采集及CNN分类模型：对FFPE胸膜组织切片（来源：萨格勒布大学医学院病理科档案，共32例患者，含MPM、胸膜炎、转移性腺癌各10例及正常胸膜2例）进行FTIR光谱测量，利用基于LeNet架构的CNN对光谱进行分类并识别最具鉴别力的波数区域。
（2）N-聚糖释放与UPLC分析：另取30例正常胸膜和30例MPM样本（均来自同一档案库，其中10例MPM和2例正常胸膜曾用于FTIR分析），经去石蜡、PNGase F酶解释放N-聚糖，以普罗卡因酰胺（ProA）标记后进行HILIC-UPLC分离，基于保留时间与葡萄糖单位（GU）的对应关系划分49个色谱峰，通过峰值丰度比较组间差异。
（3）MS结构鉴定：将同组样本的N-聚糖混合后进行HILIC-UPLC-ESI-QqTOF MS/MS分析，对差异峰中的主要N-聚糖进行组成和结构鉴定，结合诊断碎片离子确认糖链序列和连接方式。

**研究结果**
**2.1 CNN分类模型**
CNN模型达到93.42%的测试准确率、93.61%的精确率、93.42%的敏感性和93.87%的特异性。受试者工作特征曲线（ROC）显示，正常胸膜和MPM的曲线下面积（AUC）均为1，胸膜炎和转移性腺癌的AUC为0.99。混淆矩阵显示所有组织类型均达到高准确率，其中MPM的假阳性率和假阴性率均为0。

**2.2 光谱贡献分析**
通过将波长按50 cm^-1步长分组，CNN模型在碳水化合物典型吸收区（C-O、C-C伸缩及CH₂、C-OH变形振动）达到最高准确率；其中1150–1200 cm^-1区域单独准确率达97.37%。FTIR光谱图显示MPM在900–1300 cm^-1区域具有区别于其他三种胸膜组织的独特光谱指纹，提示该区域携带糖类分子特异信号。

**2.3 胸膜组织N-聚糖组学分析**
UPLC分析在正常胸膜和MPM样本中共鉴定49个N-聚糖峰。经质量控制后纳入25例正常胸膜和24例MPM样本。多组t检验（Welch校正）发现，其中16个峰（占总峰数33%）在两组间丰度显著不同：9个峰（9、14、20、23、30、33、37、40、45）在MPM中显著降低，7个峰（11、17、27、31、34、35、36）在MPM中显著升高。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）的三维得分图显示正常胸膜与MPM样本清晰分离。

**2.4 差异表达N-聚糖结构的鉴定**
MS分析显示，16个差异峰中13个峰在两组中的主要N-聚糖结构相同。MPM中上调的6个峰主要为单或双半乳糖基化的复杂双天线N-聚糖（伴或不伴核心岩藻糖和/或唾液酸），1个为高甘露糖结构（峰27在两组间主要结构不同）。MPM中下调的9个峰中，7个峰的主要结构在两组间相同：其中3个为高甘露糖结构（包括H5N2、H7N2），4个为唾液酸化复杂双天线结构。值得注意的是，高甘露糖结构H5N2在MPM中显著降低，而文献中在其他肺癌中未见改变；H7N2在MPM中亦显著降低，而文献中在肺腺癌中升高。这表明高甘露糖N-聚糖在MPM中的变化模式与常见肺癌截然不同。

**讨论与结论**
讨论部分指出：FTIR光谱联合CNN可高效区分MPM与其他胸膜病变，且最具鉴别力的光谱特征位于糖类吸收区（950–1200 cm^-1），该发现通过UPLC和MS的正交验证得以确认，证实光谱差异确实对应MPM独特的N-糖基化指纹。与既往研究对比，MPM中高甘露糖N-聚糖（尤其是H5N2和H7N2）的表达模式显著异于肺腺癌和炎症：在肺腺癌和炎症中通常升高或不变，而在MPM中却显著降低；其他高甘露糖（H6N2、H8N2）则表现出异构体转换和/或磷酸化改变。这些差异可能部分解释为何转移性腺癌和胸膜炎在先前主成分分析中聚为一类。此外，高甘露糖N-聚糖的变化可能与组织衰老（如石棉暴露诱导）或溶酶体功能障碍相关，但需进一步研究。研究受限于样本量较小（MPM 22例、正常胸膜30例），但已取得两项重大突破：一是利用FTIR-CNN精确定位糖类吸收区为MPM鉴别的关键光谱特征；二是首次通过UPLC和MS鉴定出MPM独特的N-聚糖指纹，其中高甘露糖结构H5N2、H7N2以及H6N2、H8N2的异构/修饰变化具有显著的生物标志物潜力，需在更大规模研究中验证。

**研究结论部分翻译**：
FTIR光谱与机器学习算法相结合，能够以高准确度快速区分胸膜病理状态。光谱差异主要位于聚糖吸收区域，并且与相比正常胸膜广泛存在的N-糖基化变化相关。结合UPLC和MS，本实验鉴定出MPM独特的聚糖指纹，为光谱生物标志物的分子基础提供了生物学见解。该方法鉴定出若干高甘露糖N-聚糖，即H5N2和H7N2，以及H6N2和H8N2的异构体转换和磷酸化变化，这些为MPM的鉴别诊断提供了显著的生物标志物潜力，应在更大规模的研究中进一步检验。