Resolved-GSERF: 一种从谱峰拥挤中识别目标峰精确J耦合常数的高效核磁共振方法

《Molecules》：Resolved-GSERF: A Proficient NMR Approach for Identifying Accurate J-Coupling Constants of Targeted Peaks from Spectral Congestion

　　

基于选择性重聚焦（SElective ReFocusing, SERF）的实验为辨别目标谱峰的质子-质子J耦合常数提供了有效工具。然而，SERF实验的性能高度依赖于孤立信号的选择性激发。由于存在冗余的轴向峰和不需要的耦合，从谱峰拥挤甚至谱峰重叠中提取目标峰，通常对基于SERF的实验准确分析相关耦合常数构成挑战。在此，研究人员提出一种名为resolved-GSERF的核磁共振（NMR）方法来解决这一挑战，并实现对目标谱峰的精确J耦合测量。在该方法中，采用具有适当自旋锁定混合时间的选择性磁化转移方案，将目标峰信号从谱峰拥挤区域中分离出来，从而增强谱灵敏度和分辨率。随后应用基于切片选择的GSERF重聚焦编码方案，提取目标峰的J耦合常数信息。在复杂化学和生物医学样品上的实验结果表明，所提出的方法为识别精确J耦合时遇到的谱峰拥挤挑战提供了一种实用解决方案。

**论文解读：Resolved-GSERF——从谱峰拥挤中精准解析目标J耦合的NMR新方法**

**一、研究背景与问题**
核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）波谱因无损检测和高效分析组成及分子结构，广泛应用于生物化学、石油化学和医学等领域。J耦合常数揭示核间关系、构型、构象和取代位置等关键信息。在一维¹H谱中，所有质子的J耦合以耦合分裂形式呈现为多重峰。对于小分子，多重峰分布较分散，可通过分析分裂模式重建分子结构。然而复杂分子体系中，大量多重峰在有限的化学位移范围内导致谱峰拥挤甚至重叠，使峰归属和J耦合测定极为困难。二维J分辨谱、总相关谱（Total Correlation SpectroscopY, TOCSY）及选择性TOCSY等技术虽能部分缓解拥挤，但质子间多重耦合仍使耦合常数解析复杂；同时，低谱分辨率（源于有限化学位移范围内的众多耦合分裂及磁场非均匀性）和溶质浓度变化引起的峰展宽进一步增加了测量难度。选择性重聚焦（SElective ReFocusing, SERF）技术可仅显示活性质子与被动质子间的J耦合，但单次实验仅能处理一对质子，效率低下。随后发展的GSERF方法融入切片选择空间频率编码，一次实验即可获取目标质子的全部J耦合常数信息。然而，现有GSERF方法主要适用于孤立峰，当面临谱峰拥挤重叠时，PSYCHE基方法会引入冗余轴向峰并牺牲灵敏度，而选择性COSY策略则导致信号强度大幅损失。因此，亟需一种能在谱峰拥挤条件下准确获取J耦合常数、同时保持高灵敏度和实验效率的新方法。

**二、研究内容与结论**
研究人员提出resolved-GSERF方法，通过选择性磁化转移方案分离目标峰信号，再结合基于切片选择的GSERF重聚焦编码方案精确测定J耦合常数。在复杂化学样品士的宁、生物分子17β-雌二醇和医学样品阿米卡星上的实验表明，该方法能从拥挤甚至重叠谱区中成功提取目标峰的J耦合信息，获得干净谱图，消除无关轴向峰和不必要耦合的干扰，所得J耦合常数准确可靠。该研究为复杂样品的结构分析提供了实用解决方案，论文发表在《Molecules》上。

**三、关键技术方法**
研究人员首先采用选择性磁化转移模块，该模块由三个π/2硬脉冲、一个选择性π脉冲（配合相干选择梯度G1）、一个DIPSI-2脉冲单元（配合梯度G3和G5）以及两个可选z-滤波器（含梯度G2和G4）组成。DIPSI-2的自旋锁定混合时间设为较短值（士的宁样品50 ms，17β-雌二醇样品30 ms），仅将目标孤立峰的耦合相关性传递至直接耦合质子，从而过滤冗余非目标信号。随后应用基于切片选择的GSERF重聚焦编码模块，包含一个选择性π脉冲、两个相等演化期t₁/2、一个配合弱梯度G_z的选择性π脉冲及一对相干选择梯度G6，实现空间频率编码，在间接维（F₁）记录目标峰的J耦合信息，在直接维（F₂）获得无谱峰拥挤的化学位移信息。所有实验在500 MHz液体NMR谱仪（Varian，Agilent）上进行，配备5 mm ¹H/¹³C双共振探头和z轴梯度（最大强度60 G/cm）。样品来源：士的宁（MedChemExpress，上海）、17β-雌二醇（Sigma-Aldrich，上海）、阿米卡星（Amole，上海）、γ-氨基丁酸（Solarbio，北京）。

**四、研究结果**
**1. 士的宁样品**
研究人员以质子H18α为例，其位于3.10–3.50 ppm拥挤区，无法直接选择性激发。首先通过选择性TOCSY激发孤立峰质子H17，采用50 ms短混合时间，仅将耦合传递给直接耦合的H18α和H18β，获得干净的一维谱。随后用切片选择GSERF模块激发H18α，二维谱中H18α呈单峰，其直接耦合峰H18β和H17呈双峰，测得J_H18α-H18β = 10.48 Hz，J_H18α-H17 = 5.85 Hz。对比常规GSERF显示，常规GSERF因选择性不足产生虚假H23-H18α相关及H14、H11α耦合，而resolved-GSERF谱图干净，消除了干扰。

**2. 17β-雌二醇样品**
该样品1D ¹H谱在1.00–3.00 ppm高度重叠。选择质子H11α作为激发源（孤立峰），用30 ms混合时间获取选择性TOCSY谱，清晰显示H11α及其直接耦合质子H9、H11β、H12α、H12β的信号。随后分别激发H11β和H12α获得二维resolved-GSERF谱。由H11β谱测得J_H11β-H9 = 1.87 Hz（小耦合也测出）、J_H11α-H11β = 13.49 Hz、J_H11β-H12α = 12.93 Hz、J_H11β-H12β = 4.70 Hz；由H12α谱测得J_H12α-H11α = 4.43 Hz、J_H12α-H11β = 13.02 Hz、J_H12α-H12β = 13.15 Hz。两实验测量值一致，误差在可接受范围。

**3. 阿米卡星样品**
该样品在1.8–2.4 ppm和3.3–4.2 ppm区域谱峰拥挤，目标质子Hβx与H2x重叠，Hβy与H2y拥挤。选择CHγ基团的质子Hγ（与H6'y信号重叠，但带选脉冲同时覆盖）进行选择性TOCSY（30 ms混合时间），提取出Hβx和Hβy的耦合网络。随后分别激发Hβx和Hβy，二维谱显示Hβx与Hβy、Hα、Hγ的耦合常数分别为14.22 Hz、7.55 Hz、3.76 Hz；Hβy与Hβx、Hγ、Hα的耦合常数为14.04 Hz、7.55 Hz、9.41 Hz，测量结果一致，验证了方法的可靠性。

**五、讨论与结论**
讨论部分指出，resolved-GSERF是对现有方法的补充，通过选择性磁化转移从拥挤区域提取目标峰，再以切片选择GSERF解析J耦合。在四种不同样品（士的宁、γ-氨基丁酸、17β-雌二醇、阿米卡星）上的实验验证了其性能。与先进方法Clean G-SERF和TOCSY-GSERF相比，resolved-GSERF采用切片选择而非PSYCHE模块，具备多项优势：可集成多带脉冲结合傅里叶相位编码提高信噪比；对磁场不均匀性具有内在稳健性；兼容实时采样加速采集。但当前方法在处理强耦合体系时存在局限，强耦合需要高选择性脉冲导致信号强度牺牲，这是未来研究方向。

研究结论（翻译自原文Conclusions部分）：总之，研究人员引入了一种高效的NMR方法——resolved-GSERF，以实现从谱峰拥挤中对目标质子进行精确J耦合测量，从而旨在分析复杂化学和生物样品。Resolved-GSERF采用了通过选择性磁化转移方案进行目标信号分离，以及通过基于切片选择的GSERF方案进行精确J耦合测定的概念。选择性磁化转移方案与基于切片选择的GSERF重聚焦编码方案的结合，促进了在拥挤甚至重叠谱区中目标峰的精确J耦合测量。通过受谱峰拥挤影响的化学样品士的宁、具有拥挤NMR信号的生物分子17β-雌二醇以及具有复杂分子结构的药物样品阿米卡星上的实验观测，证明了resolved-GSERF的性能。得益于对目标J耦合信息的信号过滤、可接受的信号强度以及便捷的脉冲序列扩展，resolved-GSERF为化学和生物应用中表征恒定值J耦合信息和耦合相关网络的现有NMR方法提供了有力的补充。