靶向表观基因组编辑介导Sox1ot启动子组蛋白H3乙酰化增强发育皮层中间祖细胞增殖

《Biology》：Histone H3 Acetylation at Sox1ot Promoter by Targeted Epigenome Editing Augments Proliferation of Intermediate Progenitors in Developing Cortex

　　

调控基底祖细胞亚群（包括中间祖细胞（Intermediate Progenitor Cells, IPCs））的生成与扩增是影响皮层神经发生及脑生长的关键因素。表观遗传（染色质）标记已成为皮层发育的重要调节因子，但这些因子如何在表观基因组中特异性互作以协调脑发育尚不清楚。本研究结合在体电转（In Utero Electroporation, IUE）与CRISPR-dead (d)Cas9系统，探究特定组蛋白修饰标记H3K9ac（H3第9位赖氨酸乙酰化，Histone H3 Lysine 9 Acetylation）在发育中小鼠皮层分离的中间祖细胞表观基因组中的作用。CRISPR-dCas9介导长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）Sox1ot启动子区H3K9ac添加可上调Sox1ot表达，伴随中间祖细胞池增加及神经发生增强。研究发现H3K9ac与Sox1ot之间存在互作关系，可驱动皮层中间祖细胞群扩增。通过将H3K9ac靶向Sox1ot启动子，研究人员能够刺激中间祖细胞增殖并导致皮层神经发生增强。综上，研究人员鉴定出H3K9ac是Sox1ot表达的关键表观遗传调控因子，其可能动态参与脑发育与进化过程中中间祖细胞池的扩增。

论文解读：靶向表观基因组编辑介导Sox1ot启动子组蛋白H3乙酰化增强发育皮层中间祖细胞增殖

本研究发表于《Biology》。大脑新皮层的复杂化与扩增在很大程度上依赖于基底祖细胞亚群——特别是中间祖细胞（Intermediate Progenitor Cells, IPCs，亦称TBR2?/Eomes?基底祖细胞）——的增殖与扩增能力。表观遗传修饰尤其是组蛋白乙酰化已被暗示参与新皮层进化的调控，但特定组蛋白修饰标记如何在特定细胞类型中介导IPC的增殖调控仍不明确。此外，长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）在皮层发育中的表观遗传调控作用也尚待阐明。为此，研究人员开展本研究，旨在明确H3K9ac（组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化，Histone H3 Lysine 9 Acetylation）这一染色质激活标记是否通过调控特定lncRNA的表达来驱动发育小鼠皮层中IPC的扩增，并利用细胞类型特异性CRISPR-dCas9表观基因组编辑技术进行因果验证。研究得出结论：Sox1ot（亦称lncSox1/Gm5607）启动子区的H3K9ac富集可上调其转录，进而促进IPC增殖和间接神经发生；该H3K9ac–lncSox1轴可能是哺乳动物沟回皮层进化中IPC池扩增的表观遗传基础。

主要关键技术方法

研究人员使用Tbr2/Eomes^CreER转基因小鼠，经他莫昔芬（Tamoxifen, TAM）诱导实现IPC特异性Cre重组酶表达；通过全脑HDAC抑制剂曲古抑菌素A（Trichostatin A, TSA）处理E12.5孕鼠，结合基于TBR2核内免疫荧光的荧光激活细胞核分选（Fluorescence-Activated Nuclear Sorting, FANS）分离IPC（TBR2?）与非IPC（TBR2?）细胞核；对分选细胞核进行H3K9ac染色质免疫沉淀测序（Chromatin Immunoprecipitation followed by Sequencing, ChIP-seq）及RNA测序（RNA-seq）；构建含sgRNA靶向lncSox1启动子、dCas9融合组蛋白乙酰转移酶KAT2A（催化H3K9ac）及Cre可切除mCherry-stop-cassette的表观基因组编辑载体，通过子宫内电转（In Utero Electroporation, IUE）于E13.5导入胚胎皮层，实现IPC特异性的H3K9ac靶向写入；采用ChIP-qPCR及qRT-PCR体外验证编辑效率，并通过免疫组化标记TBR2、pHH3（磷酸化组蛋白H3，标志M期）、BrdU（5-溴-2'-脱氧尿苷，标志S期）、NeuN等分析体内IPC增殖与神经元产生。

研究结果

3.1. Histone Deacetylase Inhibition Altered the Expression of Non-Coding RNAs in Cortical Intermediate Progenitors

研究人员用TSA全局提升胚胎皮层H3乙酰化后，FANS分选TBR2?与TBR2?细胞核行ChIP-seq与RNA-seq。发现TSA处理的TBR2? IPCs中，少数ncRNA基因启动子区H3K9ac升高且转录上调，其中lncSox1（Sox1ot）是唯一在TBR2? IPCs中同时显示H3K9ac显著富集（p < 0.05）与表达显著上调（p < 0.05）的lncRNA，提示其为H3K9ac在IPCs中的潜在直接下游靶点。

3.2. TSA Treatment Increased Promoter H3K9ac Level and Expression of lncSox1 in IPCs

ChIP-qPCR与qRT-PCR证实TSA处理后TBR2? IPCs中lncSox1启动子H3K9ac水平约升高2倍，lncSox1表达亦升高>2倍；而TBR2?细胞中均无显著变化。基因组浏览器轨迹显示lncSox1基因体尤其启动子区H3K9ac信号在TSA处理IPC中明显增强，表明启动子H3K9ac升高与lncSox1在IPCs中的转录激活直接相关。

3.3. Mouse IPCs Have Low Expression and Promoter H3K9ac Level of lncSox1 Compared with Human IPCs

比对已发表的小鼠与人胚胎皮层TBR2?细胞转录组数据发现：小鼠TBR2? IPCs中lncSox1表达低且启动子H3K9ac水平低，lncSox1主要在放射状胶质细胞（Radial Glia Cells, RGCs）高表达；而人TBR2? IPCs中lncSox1高表达且归类于IPC上调基因。ChIP-qPCR显示人IPC来源lncSox1启动子H3K9ac显著高于小鼠IPC，说明物种间lncSox1在IPC中的差异表达与启动子H3K9ac富集程度相关，进一步支持H3K9ac驱动lncSox1在IPCs中的表达。

3.4. Targeted H3K9 Acetylation Increases Promoter H3K9ac and Expression of lncSox1

研究人员构建sgLncSox1-dCas9-KAT2A-T2A-eGFP载体，在Neuro2A细胞中与pCAG-Cre共转染使dCas9-KAT2A表达。ChIP-qPCR显示sgLncSox1#1/#4靶向使lncSox1启动子H3K9ac显著升高（p < 0.0001），而对照组H3K18ac无变化；qRT-PCR显示lncSox1转录同步上调。证明该CRISPR-dCas9表观编辑系统可在靶位点特异性写入H3K9ac并促进lncSox1表达。

3.5. Targeted H3K9 Acetylation at lncSox1 Promoter in IPCs Elicits Observable Cortical Phenotype

通过IUE将编辑质粒与Tbr2CreER质粒共电转入E13.5 TAM预处理胎鼠侧脑室，Cre重组切除stop cassette使dCas9-KAT2A-eGFP仅在TBR2? IPCs及子代中表达。E15.5可见eGFP?细胞主要定位于SVZ（室管膜下区，Subventricular Zone）TBR2? IPC区，mCherry?未重组细胞位于VZ（脑室区，Ventricular Zone）；E18.5 eGFP与mCherry不共标，证实编辑具IPC类型特异性。

3.6. IPC-Specific H3K9 Acetylation Editing at lncSox1 Promoter Increases IPC Proliferation and Indirect Neurogenesis

E15.5表型分析显示，sgLncSox1编辑组TBR2?/GFP? IPCs中pHH3?（M期）及BrdU?（S期）比例均显著高于sgControl组，表明IPC增殖增强。E18.5分析显示编辑组GFP?/NeuN?神经元（源自IPC间接神经发生）与mCherry?/NeuN?神经元（源自RGC直接神经发生）比值升高，直接神经发生比例及凋亡率无差异。说明lncSox1启动子H3K9ac靶向升高通过促进IPC扩增而非直接影响RGC或直接神经发生来增强皮层间接神经发生。

讨论与结论总结

讨论指出，本研究结合细胞类型特异性CRISPR-dCas9表观基因组编辑与FANS纯化，鉴定出H3K9ac–lncSox1调控轴驱动发育皮层IPC扩增。lncSox1在人中高表达于人IPC且与高启动子H3K9ac相关，在小鼠IPC中本底低，人工提升小鼠IPC中lncSox1启动子H3K9ac足以模拟人IPC样表型（IPC池扩大、间接神经发生增加），提示该轴可能在进化中参与沟回皮层IPC池的扩充。研究也指出表观编辑存在持续性、脱靶及细胞情境依赖性等局限。

结论（Conclusions）：组蛋白乙酰化通过lncRNA介导调控皮层神经发生。H3K9ac被鉴定为IPCs中由特定lncRNA（如lncSox1/Sox1ot）介导的关键表观遗传标记。研究人员推测所揭示的皮层发生中H3K9ac–lncSox1调控轴可能是发育中哺乳动物沟回皮层神经祖细胞池扩增的进化需求体现。该表观基因组编辑范式可用于特定细胞群靶向基因操作，以解析（表）遗传因素在细胞生物学过程中的贡献，并为基于细胞微环境异常的疾患治疗提供线索。