《Biosensors and Bioelectronics》：TOPS-CRISPR: Thermally-regulated and oligonucleotide-mediated one-pot CRISPR-Cas12a assay for ultra-sensitive and rapid on-site diagnostics
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季书森|王斌|严毅|张传岭|任海渊|杨俊杰|魏贤|侯伟|黄莫汉|宋金兆|王守宇|邱龙|王海东中国山西省晋中市，山西农业大学兽医学院，动物疾病研究、预防与控制山西省重点实验室，邮编030801摘要CRISPR-Cas12a因其强大的信号放大能力以及简洁的crRNA设计，已成为分子诊
季书森|王斌|严毅|张传岭|任海渊|杨俊杰|魏贤|侯伟|黄莫汉|宋金兆|王守宇|邱龙|王海东
中国山西省晋中市，山西农业大学兽医学院，动物疾病研究、预防与控制山西省重点实验室，邮编030801
摘要
CRISPR-Cas12a因其强大的信号放大能力以及简洁的crRNA设计，已成为分子诊断领域的重要工具。然而，其不受控制的酶活性往往会影响一体化检测流程的应用。尽管现有的时间或空间调控策略能够缓解这一问题，但通常会增加操作复杂性或成本。在此，我们设计了一种基于热调控和寡核苷酸介导的CRISPR-Cas12a一体化系统（TOPS-CRISPR），该系统采用可编程的抑制策略，通过长度和结合位点可调控的互补RNA抑制剂，实现对LbCas12a-crRNA核糖核蛋白复合物的高效且可逆的空间抑制，从而解决了一体化检测中放大与切割之间的矛盾。TOPS-CRISPR不仅操作简单、成本低廉，其灵敏度还比传统一体化平台高出60倍以上。我们通过在实际样本和加标样本中准确检测布鲁氏菌和链球菌，证明了TOPS-CRISPR的临床应用价值。此外，该系统可与快速样本处理、冻干试剂以及微型化工作流程无缝整合，使得在50分钟内即可完成现场病原体鉴定。
引言
CRISPR（规律间隔短回文重复序列）及其相关（Cas）蛋白的发现，极大地推动了分子诊断领域的发展。除了在基因组编辑方面的革命性作用外，CRISPR-Cas系统还被用作高度特异性且可编程的核酸检测工具，有望实现新一代的即时检测技术（Chertow 2018；Hou等人2026；Pickar-Oliver和Gersbach 2019）。由于它们能与等温核酸扩增技术如重组聚合酶扩增技术和环介导等温扩增技术轻松结合，因此能够以极高的灵敏度检测微量病原体DNA或RNA，为临床和现场环境中的快速疾病识别开启了新篇章（Chen等人2018；Gootenberg等人2017；Li等人2019；Yi等人2025）。在众多用于诊断的CRISPR-Cas系统中，Cas12a（ formerly Cpf1）因诸多固有优势而成为最常用的核酸检测系统（Huang等人2025a；Zang等人2026）。首先，它在识别目标后能对单链DNA报告基因展现出强大且快速的trans-切割活性，从而实现强烈的信号放大（Chen等人2018；Huyke等人2022；Li等人2018a；Li等人2018b）。其次，它的crRNA结构较为紧凑，无需额外的tracrRNA（Zetsche等人2015），这简化了化学合成过程并降低了成本。再者，最新研究表明它既能识别DNA靶标，也能识别RNA靶标（Rananaware等人2023）。
要实现真正可应用的即时检测技术，关键在于开发一体化检测方法。这种检测格式能够降低操作复杂性，减少扩增产物气溶胶带来的污染风险，并便于自动化操作。然而，使用Cas12a构建此类系统却面临诸多挑战。主要问题在于Cas12a的活性难以控制，它可能会破坏NAA模板的完整性，进而显著削弱甚至导致扩增失败。因此，开发一体化检测系统一直是CRISPR诊断研究领域的热点课题（Chen等人2025；Liu等人2025）。人们已经付出了大量努力来解决NAA系统与CRISPR系统之间的不兼容性问题，主要通过严格的或灵活的空间分隔方式，以及调节Cas12a核糖核蛋白复合物活性的方法来实现。严格的空间分隔通常依靠设计精良的微流控平台或特殊装置（Cai等人2025；Xing等人2023），而灵活的空间分隔则利用半透性屏障或不同粘度或密度的液体之间的界面（Li等人2023）。不过，这些平台往往需要额外的设备，从而导致成本上升、操作更加复杂，进而限制了其在即时检测中的应用。
为克服这些限制，人们提出了多种调节活性的策略，包括蛋白质工程改造（Cao等人2025；Tong等人2025）、非传统原间隔区相邻基序改造（Fu等人2025；Zheng等人2024）、特定分子抑制剂的使用（如硫酸肝素）（Cheng等人2025），以及crRNA的修饰（如crRNA延长、突变、分割等）（Han等人2025；Ma等人2025；Nguyen等人2020；Xiao等人2025）。在这些策略中（见补充表S1），很多方法都会不可逆地降低RNP的活性，从而削弱CRISPR/Cas系统的信号放大优势。最近，人们可以通过可逆调节Cas蛋白或crRNA来实现对CRISPR-Cas系统活性的光学控制（Hu等人2022；Hu等人2025；Tian等人2025），但这些方法不仅需要昂贵的化学修饰合成手段，还需依赖专门的激活设备（如紫外线光源）。因此，开发更简单、更通用的CRISPR-Cas12a系统调控方法依然是一个挑战。
温度调控是一种简单且易于控制的替代方案。近期有一些研究开始探索这一途径，例如，人们利用Cas12b的天然热稳定性，通过先在较低温度下进行反应，再升至适宜的高温范围进行检测，从而实现对其活性的时间控制（Feng等人2025；Huang等人2025b；Zhao等人2025）。人们普遍认为，LbCas12a的最适温度在37℃-42℃之间，由于其可能存在热不稳定性，因此不适合采用这种高温激活策略。目前还缺乏对其在广泛温度范围内的切割活性进行全面动力学分析，因此，基于Cas12a的温度调控一体化策略尚未有相关报道。
我们利用LbCas12a，系统地研究了其广泛的活性范围以及独特的最佳温度区间，进而设计出了基于热调控和寡核苷酸介导的CRISPR-Cas12a一体化系统（TOPS-CRISPR）。TOPS-CRISPR采用可编程的抑制策略，通过长度和结合位点可调控的互补RNA抑制剂，实现对LbCas12a-crRNA RNP复合物的高效且可逆的空间抑制。TOPS-CRISPR的工作机制如图1A所示。传统的CRISPR一体化检测方法存在RPA扩增与Cas12a切割同步进行且无法实现时间控制的问题。Cas12a的持续cis-切割会不断降解原始模板和RPA扩增产物，阻碍目标物质的积累，减弱其cis/trans双重核酸酶活性，最终导致荧光信号较弱、检测灵敏度较低。而我们的系统则通过可逆的温度调控实现了分时的扩增与检测。在39℃时，RNA寡核苷酸抑制剂会与crRNA紧密结合，形成空间阻碍，从而抑制LbCas12a的cis-切割，保护核酸模板和扩增产物，使其能够充分积累用于RPA扩增。将温度升高到52℃后，RNA与crRNA的杂交作用会被打破，抑制剂也会解离，此时Cas12a的cis和trans切割活性会完全恢复。经过预富集的扩增产物会进一步增强荧光信号，使得该系统的灵敏度远高于传统的一体化检测方法。值得注意的是，TOPS-CRISPR的灵敏度可与无需专用电化学仪器的石墨烯纳米墙单DNA电化学传感器相媲美（Akhavan等人2014；Akhavan等人2012）。我们还通过调整寡核苷酸的长度和结合位点优化了抑制剂的设计，并通过分子模拟和亲和力动力学分析阐明了其调控机制。在即时检测应用方面（见图1B），该系统被用于检测布鲁氏菌和B群链球菌。结合快速的核酸提取技术、冻干试剂以及智能手机辅助的便携式设备，这一集成化平台能够在50分钟内完成从样本到检测结果的完整流程，实现可靠的现场检测，从而大大推动了便捷型分子诊断技术的发展。
章节摘录
材料
所有的引物、探针、crRNA、RNA寡核苷酸以及质粒均由上海桑根生物科技有限公司合成。完整的序列信息详见补充表S2。样本裂解缓冲液RLB15（产品编号CNA02027）、RPA试剂盒（产品编号WLB8201）以及LbCas12a（产品编号32108）分别由苏州克瑞博生物技术有限公司、常州安普未来生物技术有限公司以及上海托洛生物技术有限公司提供。具体而言，RPA试剂盒包含三个核心组分
热调控型crRNA间隔区阻断可实现CRISPR-Cas12a活性的可逆调控
LbCas12a的切割活性随温度变化，这说明其活性可以通过寡核苷酸阻断策略实现可逆调控。为了系统地研究其cis-切割和trans-切割活性的温度响应特性，我们以双链DNA和单链DNA作为底物，研究了LbCas12a在35℃至65℃温度范围内的酶学动力学特性（见图1A）。这两种切割活性
讨论与结论
crRNA间隔区决定了CRISPR-Cas系统的特异性以及潜在的异常切割现象，是crRNA工程改造的核心区域（Ma等人2025）。我们的结构和功能实验表明，靶向3′端间隔区的RNA抑制剂比靶向5′端间隔区的抑制剂具有更强的抑制效果，这是因为5′端的种子区域以及靠近RuvC口袋的3′端间隔区起到了关键作用（Yamano等人2016），这一结果与Cas12b的调控特征一致（Dong等人2016；Huang等人2025b）。抑制剂与crRNA形成的双链结构的热力学特性（GC含量等）也影响了抑制效果
CRediT作者贡献说明
黄莫汉：验证、方法学、数据整理。宋金兆：写作——审阅与编辑、指导。 侯伟：验证、方法学。 王守宇：写作——审阅与编辑、指导、资源提供、项目管理、方法学、概念设计。 邱龙：写作——审阅与编辑、指导、资源提供、项目管理、方法学、正式分析、概念设计。 季书森：写作——初稿撰写、方法学、正式分析、数据整理、概念设计。
伦理声明
本研究已获得浙江萧山医院伦理委员会的批准（伦理审批编号：K2022035），并且已获得所有患者的知情同意。
数据可用性声明
与本研究相关的数据，可在合理请求下从相应作者处获取。
资金支持
本研究得到了山西省三晋英才支持计划（项目编号：SJYC2024032）的资助。此外，还得到了山西省兽医医药产业技术创新研究院（产业学院）（1331计划项目，编号2025CXYRH-042）、山西省兽医医药产业技术创新战略联盟（编号2025CXYRH-046）、青年科技领军人才计划（编号2024YQPYGC02）以及中国浙江省自然科学基金的资助
利益冲突声明
? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
