《Brain Research》：Functional deficits in immortalized microglial cell lines limit their utility for modeling neuroinflammation
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Xiaoyan Xiong|Qilong Wu|Xuecheng Qiu|Suning Ping中国广东省深圳市中山大学深圳校区中山医学院神经生物学研究中心组织学与胚胎学系摘要背景小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻免疫细胞，在大脑发育和疾病发生中起着关键作用。虽然原代小胶质细胞是体
Xiaoyan Xiong|Qilong Wu|Xuecheng Qiu|Suning Ping
中国广东省深圳市中山大学深圳校区中山医学院神经生物学研究中心组织学与胚胎学系
摘要
背景
小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻免疫细胞，在大脑发育和疾病发生中起着关键作用。虽然原代小胶质细胞是体外研究的金标准，但由于其增殖能力有限，人们开始广泛使用永生化细胞系，其中BV2细胞系最为常见。然而，越来越多的证据表明，BV2细胞在功能上与原代小胶质细胞存在显著差异。
目的
旨在构建经过优化的慢病毒介导的人端粒酶逆转录酶（hTERT）永生化小胶质细胞系，并比较这些细胞系与原代小胶质细胞以及BV2细胞系在功能上的相似性。
方法：我们通过慢病毒hTERT转导建立了两种小鼠小胶质细胞系（CM-A1、CM-A3），并全面评估了它们的细胞特征，包括CD11b表达、细胞形态、吞噬活性以及对脂多糖的炎症基因转录反应。
结果
与BV2细胞相比，CM-A1和CM-A3表现出更高的CD11b表面表达和更强的基础吞噬能力。不过，所有永生化细胞系都存在明显的功能缺陷，表现为CD11b表面表达降低、LPS刺激后的形态变化减弱、LPS诱导的吞噬作用增强能力下降，以及促炎基因的诱导作用减弱。
结论
这些研究结果表明，无论是hTERT永生化的微胶质细胞系还是BV2细胞系，都无法完全再现原代小胶质细胞的动态功能反应，这强调了在神经免疫学研究中选择合适模型的重要性。
引言
小胶质细胞作为中枢神经系统中的常驻免疫细胞，在大脑发育、生理平衡维持以及疾病发生过程中发挥着重要作用（Borst等人，2021；Colonna和Butovsky，2017）。小胶质细胞会根据不同环境处于不同的活化状态，表现出从维持生理平衡到吞噬清除物质以及分泌促炎细胞因子的多种表型（Borst等人，2021；Colonna和Butovsky，2017）。由于分离和培养原代小胶质细胞存在技术难题，比如增殖能力有限且不同批次之间存在差异，因此永生化小胶质细胞系便成为常用的实验模型（Henn等人，2009；Mazzeo等人，2022）。
BV-2细胞系是通过用携带v-raf/v-myc致癌基因的逆转录病毒（J2）转导原代小胶质细胞培养物而建立的，是目前应用最广泛的小胶质细胞实验模型之一（Henn等人，2009）。尽管该细胞系使用方便且具有无限的增殖潜力，但越来越多的证据表明，它在功能上与原代小胶质细胞存在显著差异（Das等人，2016；Horvath等人，2008）。尤其是，BV-2细胞在炎症表型、转录组及蛋白质组特征方面都与原代小胶质细胞有所不同（Das等人，2016；Luan等人，2022）。这些局限性促使人们努力开发出能更好模拟生理状态下小胶质细胞功能且便于实验操作的细胞系。
近年来，利用SV40大T抗原或人端粒酶逆转录酶进行细胞永生化的技术取得了进展，为培育出更接近原代小胶质细胞的细胞系提供了新途径（Garcia-Mesa等人，2017；McLaurin等人，1995）。这两种方法都能实现细胞克隆扩增，同时保留小胶质细胞的核心特征（Munoz-Gutierrez等人，2015）。与会破坏p53和Rb家族肿瘤抑制通路的SV40 LT不同，hTERT是通过延长端粒来延长细胞复制寿命的（Bodnar等人，1998）。这种机制能减少基因组紊乱，更好地保持细胞内的生理信号传导通路（Jiang等人，1999；Shitova等人，2024）。跨细胞类型的研究也证实，hTERT永生化的细胞具有更稳定的核型，其功能表现也比用病毒致癌基因永生化的细胞更接近原代细胞功能（Shitova等人，2024）。不过，目前仍缺乏系统的直接比较研究，以明确hTERT修饰的小胶质细胞系是否优于传统模型（如BV2），以及这些工程化细胞系在多大程度上能够模拟真实的原代小胶质细胞生理功能。
在本研究中，我们通过慢病毒介导的hTERT过表达技术，从原代小鼠皮质混合胶质细胞培养物中建立了两种永生化小胶质细胞系，分别命名为CM-A1和CM-A3。这些克隆细胞表现出不同的形态特征——一种为分支状，另一种为圆形，且这些形态在长期传代过程中保持稳定。我们通过检测表面标志物表达、增殖能力、LPS诱导的形态激活、髓鞘吞噬作用以及炎症基因表达谱，对这三种细胞系进行了全面的功能比较。研究结果表明，尽管CM-A1和CM-A3在功能上相比BV2细胞有了一定改善，但所有永生化细胞系在关键的生理反应方面都与原代小胶质细胞存在显著差异，尤其是在吞噬调节和炎症基因转录方面。这些发现进一步强调了在研究小胶质细胞时选择合适模型的重要性，同时也凸显出在开发兼具实验可行性和生理相关性的细胞模型方面的挑战。
章节节选
伦理审批声明
本研究中所进行的所有涉及C57BL/6小鼠的动物实验均获得了徐州医科大学动物实验伦理委员会的批准，官方伦理审批编号为202208S020。所有实验用小鼠均在无特定病原体动物实验室中饲养，该实验室具备恒定温度（22±2℃）、恒定湿度（55±5%）以及12小时光照/黑暗周期的环境条件。
小鼠原代混合胶质细胞培养
原代混合皮质胶质细胞培养是采用出生后1–3天的小鼠
通过慢病毒介导的hTERT表达建立并鉴定永生化小胶质细胞系
为了建立永生化小胶质细胞系，我们对原代混合胶质细胞培养物进行了hTERT转导。转导两周后，根据细胞形态的差异筛选出了两个克隆，分别命名为CM-A1和CM-A3（见图1A）。从P1代到P5代连续传代过程中，CM-A1细胞始终保持分支状形态，具有大量的分支结构，而CM-A3细胞则呈现圆形形态，分支较少（见图1A）。这一形态特征
讨论
为了克服原代小胶质细胞培养存在的增殖能力有限、个体间差异大以及动物实验相关的伦理问题，人们开发出了多种永生化小胶质细胞系。在本研究中，我们建立了CM-A1和CM-A3两种永生化小胶质细胞克隆，它们不仅形态稳定，还能保持典型的小胶质细胞标志物表达。随后，我们对比了这三种细胞系的功能特征
结论
综上所述，通过对永生化小胶质细胞系与原代小胶质细胞进行系统比较，我们发现虽然这些永生化克隆细胞在一定程度上保持了核心表面标志物的表达和基础吞噬能力，但在面对炎症刺激时，其关键的功能反应却受到了明显影响，比如LPS诱导的吞噬作用增强以及强烈的炎症基因转录激活等功能都会出现减弱。这些发现进一步凸显了在模型选择上需要谨慎对待
数据可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。
CRediT作者贡献说明
Xiaoyan Xiong：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，验证，正式分析，数据整理。Qilong Wu：写作——审阅与编辑，可视化，正式分析。Xuecheng Qiu：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，资金获取，数据整理，概念设计。Suning Ping：写作——审阅与编辑，监督，资金获取，概念设计。
资助情况
本研究得到了以下机构的财政支持：中国国家自然科学基金（项目编号82401625，资助对象XQ；项目编号82302105，资助对象SP）、深圳市科技创新计划（项目编号JCYJ20250604174752069，资助对象SP）、徐州医科大学基础医学学科发展基金（项目编号JC20250005，资助对象XQ）。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢
感谢中山大学深圳校区医学院医学科学核心设施团队提供的技术支持。
