小鼠胚胎干细胞衍生的神经干细胞在分化与培养过程中的热休克反应动态变化

《Brain Research》：Dynamics of heat shock response during neural differentiation and culture of mouse embryonic stem cell-derived neural stem cells

　　

大森宏之|野上治郎|高桥诚|柴田正良

日本健康科学大学健康科学学院物理治疗系，日本埼玉县萨泰町平塚2-555，邮编340-0145

摘要

中枢神经系统在发育过程中极易受到热暴露的影响，但不同神经分化阶段对热休克反应的差异目前尚不清楚。我们利用小鼠胚胎干细胞衍生的神经干细胞模型，研究了细胞对急性热休克的阶段性反应。实验中，细胞在第0天、第2天或第6天被置于43–44°C环境中20分钟，随后检测细胞的存活率、凋亡情况、Hsp基因表达以及谱系标记物的表达情况。在第0天受热休克处理的细胞存活率显著下降，同时caspase-3/7活性上升；而在后期阶段的细胞存活率逐渐恢复，caspase活性没有明显增加，不过和的表达则明显增强。到第6天时，热休克对神经元MAP2基因的表达影响不大，而GFAP mRNA水平显著降低，这表明在热休克条件下星形胶质细胞的分化暂时受到抑制。这些研究结果展示了神经分化过程中热休克反应的阶段性变化：后期阶段的细胞存活能力提高，死亡风险降低，同时星形胶质细胞的分化也暂时减弱。

引言

为了抵御环境温度突然升高等外部压力，细胞会激活一种高度保守的细胞保护机制——热休克反应。这种反应是细胞在恶劣环境下维持结构和功能完整性的重要生存策略。热休克蛋白是该反应的核心成分，它们在细胞内发挥分子伴侣的作用，通过识别错误折叠或变性的蛋白质，帮助其恢复到正常的功能结构，同时防止受损蛋白质聚集形成可能有毒的团块（Hartl等人，2011年）。此外，热休克蛋白还是细胞生存信号网络的重要组成部分，它们能够直接或间接抑制细胞色素释放和caspase活化等信号，从而在应激条件下维持细胞存活（Takayama等人，2003年；Parcellier等人，2003年）。在中枢神经系统中，高热和脑缺血等外部压力会促使热休克蛋白大量表达。这种内在的保护机制能够提升神经元和胶质细胞对急性损伤及继发性损害的抵抗力（Franklin等人，2005年；Behdarvandy等人，2020年）。然而，这一保护机制在发育过程中会受到调控，因为高热会对胚胎大脑造成直接损伤，这也凸显出发育中的中枢神经系统的脆弱性（Edwards，2006年）。在发育早期的未成熟神经细胞比成年神经元对热休克更敏感，这很可能是因为它们的热休克反应不够成熟或不足（Walsh等人，1997年；White等人，2007年）。最近使用小鼠胚胎体与人脑类器官的研究表明，39–41°C的短期热休克处理会增加外层神经元的凋亡，扰乱三胚层神经细胞的分化，并导致神经上皮管腔结构异常（Intawicha等人，2025年），这说明即使短暂的温度升高也会造成严重且可能不可逆的损伤，包括广泛的细胞死亡以及关键发育过程的紊乱。

在中枢神经系统的发育过程中，神经干细胞首先进行增殖（Liang等人，2024年），随后分化为神经元和胶质细胞，依次形成具有不同表型的细胞群体（Coquand等人，2024年）。这些神经干细胞会在成年大脑中持续存在，为海马齿状回（Kempermann等人，2018年）和室管膜下区（Gage，2000年；Temple，2001年；Obernier和Alvarez-Buylla，2019年）等区域的神经发生提供支持。研究表明，这些神经细胞类型的应激反应能力和存活率在分化过程中会发生动态变化（Pfisterer等人，2017年；Semkova等人，2022年）。因此，了解不同发育阶段对热耐受性的变化，对于研究神经疾病模型以及应用在再生医学领域都具有非常重要的意义。先前的研究已经表明，不同细胞类型和分化阶段对热休克的反应存在差异。例如，原代培养的大鼠海马神经元中HSP70的诱导程度显著降低（Marcuccilli等人，1996年），而在PC12细胞中，随着神经元的分化，HSP70的诱导程度也会下降（Hatayama等人，1997年）。在人类神经前体细胞中，42°C的高热应力会抑制神经元分化，并导致神经球缩小（Vishwakarma等人，2017年）。最新的研究还表明，HSP70的过表达也会影响神经干细胞的存活率和分化潜力（Hossain等人，2017年；Chen等人，2022年）。由此可见，神经分化过程中的热休克反应存在很大的异质性；不过大多数以往的研究都依赖于原代培养，这就限制了人们进行分阶段、时间序列的定量分析。

近年来，从胚胎干细胞和诱导多能干细胞中培育高质量神经干细胞的技术取得了显著进展（Roman等人，2024年；Sawamoto等人，2025年）。尽管如此，关于这些细胞在移植后的植入以及分化控制方面仍然存在诸多挑战。这类疗法的临床成功在很大程度上取决于多能干细胞衍生的神经细胞能否适应移植后的环境，并保持适当的分化状态和功能表达。由多能干细胞衍生的神经细胞作为实验模型具有特别的价值，因为可以精确控制它们的分化阶段，从而在体外重现发育过程。本研究中使用的神经干细胞球方法（Nakayama和Inoue，2006年）能够高效且可重复地从小鼠胚胎干细胞中培育出同质的神经干细胞。在该体系中，神经元和胶质细胞的分化顺序与体内单层培养条件下的情况相似，因此非常适合用于分析不同分化阶段神经干细胞的热休克反应。此外，该模型还可以详细研究从神经前体细胞到成熟神经细胞的各个发育阶段的应激反应（Isono等人，2012年；Shibata等人，2016年）。这种分阶段的评估有助于深入了解移植后神经干细胞在应激条件下的存活率和分化特性。

在我们之前的研究中，将处于增殖状态、尚未分化的小鼠神经干细胞置于43°C环境中20分钟的热休克处理，会导致细胞总数减少且分化进程延迟（Omori等人，2014年）。值得注意的是，在培养的非常早期阶段，热休克处理就会引发明显的细胞凋亡。相反，当神经干细胞培养的时间更长时，经过热休克处理后它们的存活率会有所提高，同时基因的表达也会增加，细胞死亡相关因子的活性则会受到抑制，这表明热休克反应会受到培养时间的调控（Omori等人，2021年）。此外，我们之前的研究还发现，小鼠胚胎干细胞衍生的神经干细胞对43°C和44°C的反应存在明显差异，43°C仅会引起中等程度的应激反应，而44°C则会导致严重的细胞毒性（Omori等人，2014年），这说明哪怕只有1°C的差异也会带来截然不同的反应结果。本研究的主要目的是分析短期热休克处理对正处于神经分化过程中的神经干细胞的影响，重点关注神经元和胶质细胞标记物表达的时间规律。通过比较早期分化阶段与后期分化阶段的热休克反应，本研究旨在了解细胞的敏感性是如何随分化表型而变化的。通过检测细胞的存活率、凋亡活性、Hsp基因表达以及分化标记基因的表达动态，本研究阐明了热休克反应是如何以分化阶段为依据而发生变化的。

章节节选

神经干细胞的制备与增殖

本研究中使用的小鼠胚胎干细胞来自RIKEN生物资源研究中心提供的RBRC-AES0140品系。这些小鼠神经干细胞是通过Nakayama和Inoue建立的神经干细胞球方法进行分化的（Nakayama和Inoue，2006年）。在用小鼠 feeder细胞维持并扩增这些胚胎干细胞后，将它们转移到35毫米的非贴壁培养皿中（Sumitomo Bakelite公司生产），并在含有特定成分的神经诱导培养基中悬浮培养4天。

神经干细胞在分化过程中经热休克处理后存活率的变化

在热休克处理（43°C或44°C下处理20分钟）后的24小时继续进行分化培养后，使用CellTiter-Glo发光 assay检测细胞的存活率，检测时间点为第0天、第2天和第6天（见图2）。组间差异通过Welch’s ANOVA检验后再进行Games–Howell事后检验进行分析。在第0天时，无论是43°C还是44°C的环境下，细胞的存活率都比37°C时显著降低（Welch’s ANOVA检验结果：F(2,8.99) = 511.93，p值=5.48×10?1?；Games–Howell检验结果：）

讨论

在本研究中，我们比较了胚胎干细胞衍生的神经干细胞在不同分化阶段对热休克的反应。这种反应会随着培养时间的延长而发生变化，进而显著影响细胞的存活率、凋亡情况以及Hsp基因的表达动态。值得注意的是，在胶质细胞分化阶段开始时，热休克处理会抑制作为星形胶质细胞标志物的GFAP基因的表达。这些研究结果表明，细胞对热休克的敏感度既与发育阶段有关，也与细胞谱系有关，这说明热休克会影响胶质细胞分化的时机。

结论

本研究表明，胚胎干细胞衍生的神经干细胞的热休克反应在很大程度上取决于培养时间和分化阶段。处于未分化或早期分化阶段的细胞对热休克的敏感度更高，而那些接近胶质细胞分化阶段的细胞则表现出更高的耐受性，细胞存活率也会恢复。这些研究结果阐明了在神经细胞早期分化过程中，细胞对应激反应的敏感性会发生的动态且具有阶段特异性的变化。

CRediT作者贡献说明

大森宏之：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿撰写，可视化处理，项目管理，方法学设计，资金获取，概念构思。野上治郎：论文撰写——审阅与编辑，研究指导，资源提供，方法学设计。高桥诚：论文撰写——审阅与编辑，正式数据分析。柴田正良：论文撰写——审阅与编辑，研究指导，资源提供，方法学设计，概念构思。

资助信息

本研究得到了日本学术振兴会KAKENHI项目的资助，项目编号为JP21K17518。

利益冲突声明

作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢Inoue Nobuo博士和Nakayama Takashi博士在本研究初期所提供的技术支持和宝贵建议。