野生型及APP NL-G-F阿尔茨海默病小鼠模型中APP和GABABR1亚型的细胞特异性表达

《Brain Research》：Cell-specific expression of APP and GABABR1 isoforms in wild-type and the APP NL-G-F mouse model of Alzheimer’s disease

　　

萨马·胡马姆|多米尼卡·西奥德拉克|米娜·塞沙德里|吉迪恩·B·哈勒姆|内森·P·佩赞特|大卫·R·斯坦福|卡桑德拉·萨利纳斯-萨利纳斯|伊冯娜·M·托马森|罗伯托·桑廷-马尔克斯|迈克尔·B·斯托特|威拉德·M·弗里曼|考特尼·G·蒙哥马利|希瑟·C·赖斯

美国俄克拉荷马州俄克拉荷马市73104，俄克拉荷马医学研究基金会衰老与代谢研究项目

摘要

淀粉样前体蛋白是一种I型跨膜蛋白，经过蛋白水解作用可生成β-淀粉样蛋白，这是阿尔茨海默病患者大脑中淀粉样斑块的主要成分。APP的蛋白水解过程还会产生可溶性APPα，它通过γ-氨基丁酸B型受体调节突触传递和神经突生长。sAPPα会特异性结合GABA_BR亚基1的1a型，该类型含有R1b所没有的两个“寿司结构域”。在本研究中，我们明确了大脑中APP和GABA_BR1a的细胞类型特异性表达模式，并分析了在APP NL-G-F阿尔茨海默病模型中这些表达模式的变化。我们采用了两种方法检测成年小鼠少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞、星形胶质细胞和神经元中R1a和R1b亚型的相对RNA水平。我们开发了一种针对特定亚型的RNA测序分析流程来分析公开的数据集，同时从单个小鼠大脑中分离出这些细胞类型，使用特定亚型的引物进行RT-qPCR检测。结果显示，不同细胞类型中APP和GABA_BR1的表达存在差异：APP和GABA_BR1a在少突胶质细胞中的表达水平最高，而GABA_BR1b在星形胶质细胞中的表达水平最高。尽管小胶质细胞表达的GABA_BR水平相对较低，但在APP NL-G-F小鼠模型中，它们的GABA_BR表达变化最为显著，且这种变化具有性别和年龄特异性。我们的研究结果为未来研究APP-GABA_BR信号通路在健康状态和阿尔茨海默病中的作用提供了潜在的细胞类型依据。

引言

淀粉样前体蛋白是一种I型跨膜蛋白，不仅存在于大脑中，也存在于其他器官中（van der Kant和Goldstein，2015）。1987年，在寻找β-淀粉样肽的来源过程中发现了APP（Goldgaber等人，1987；Kang等人，1987；Tanzi等人，1987），而β-淀粉样肽正是与阿尔茨海默病相关的淀粉样斑块的主要成分（Delport和Hewer，2022）。APP经过蛋白水解作用后，除了生成β-淀粉样肽外，还会产生其他在大脑中起重要作用的片段。APP可以先被α-或β-分泌酶切割，然后再被γ-分泌酶切割。α-分泌酶在β-淀粉样肽生成区域进行切割，从而阻止β-淀粉样肽的产生，同时产生可溶性APPα、P3以及APP的细胞内结构域。β-分泌酶则启动淀粉样蛋白生成途径，产生sAPPβ、β-淀粉样肽以及APP的细胞内结构域。此外，APP还可能在α-或β-切割之前被η-分泌酶切割，生成sAPPη以及其他片段Aη-α或Aη-β（Hefter等人，2020）。全长APP及其片段参与着多种重要的大脑功能（Müller等人，2017），它们可以调节轴突生长、树突分支、神经发生以及神经元迁移等神经发育过程（Chau等人，2023；Müller等人，2017）。在成熟的神经元中，全长APP和sAPPα可以调节突触结构、突触可塑性以及神经递质传递（Hefter等人，2020；Kruse等人，2025）。虽然APP最为人熟知的角色是在神经元中的作用，但它也与胶质细胞和内皮细胞的功能有关（Dunot等人，2023）。APP基因敲除的小鼠会出现轴突髓鞘形成不良、小胶质细胞和星形胶质细胞的炎症反应减弱、星形胶质细胞中的线粒体碎片化，以及内皮细胞产生的一氧化氮减少等现象（Truong等人，2019；Carrano和Das，2015；Montagna等人，2019；d’Uscio等人，2018）。在人类干细胞衍生的小胶质细胞中，APP基因敲低会损害与小胶质细胞活化相关的电压门控质子通道的功能（Zhao等人，2025）。尽管有这些研究结果，APP在胶质细胞中的作用仍然很大程度上未被明确，相关研究也相对较少。

识别与APP及其片段相互作用的蛋白质是阐明其生理功能的关键策略之一（Müller等人，2017）。2019年，研究发现全长APP以及其分泌的外域sAPPα都与γ-氨基丁酸B型受体存在相互作用（Rice等人，2019）。GABA_BR属于C类G蛋白偶联受体，是一种必须以异二聚体形式存在的受体（Terunuma，2018）。GABA_BR1亚基包含内源性的激动剂结合位点，而GABA_BR2则与G蛋白在细胞内部相连。GABA_BR1亚基有多种亚型，其中R1a和R1b是人类GABA_BR多样性的主要两种变异形式（Terunuma，2018）。这两种亚型之间的主要区别在于R1a的N端存在两个“寿司结构域”，而R1b由于启动子使用方式的差异没有这两个结构域（Huang，2006）。正是这些“寿司结构域”使得GABA_BR1a亚基倾向于定位于轴突末端（Biermann等人，2010；Vigot等人，2006）。全长APP以及其脱落的外域sAPPα都能与GABA_BR1a的N端第一个“寿司结构域”结合（Rice等人，2019）。研究表明，sAPP与GABA_BR的相互作用会降低突触囊泡的释放，进而影响海马区的突触可塑性和神经递质传递（Rice等人，2019），同时也会影响神经突的生长（Barber等人，2026）。此外，APP的缺失还会降低GABA_BR介导的突触前抑制作用以及轴突中的GABA_BR含量（Dinamarca等人，2019）。目前仍在进行研究以弄清sAPPα-GABA_BR信号通路的下游作用机制，因为有研究认为它可能与典型的GABA_BR信号通路有所不同（Rem等人，2023）。

在大脑中，GABA_BR1a和GABA_BR1b都存在于大多数神经元亚群中，包括谷氨酸能神经元、多巴胺能神经元以及GABA能神经元（Bettler等人，2004）。神经元利用典型的GABA_BR信号通路来调节突触传递以及兴奋性与抑制性之间的平衡等关键过程（Terunuma，2018）。GABA_BRs与Gα_i/o和Gβγ蛋白结合，从而抑制腺苷酸环化酶以及突触前的Ca2+通道，降低突触前物质的释放概率，同时激活突触后的GIRK通道，降低神经元的兴奋性（Bettler等人，2004；Syrovatkina等人，2016；Terunuma，2018）。GABA_BR的抑制功能在神经元中已被广泛研究，但在胶质细胞中的研究相对较少。少突胶质细胞表达具有功能的GABA_BR1，它能调节腺苷酸环化酶的信号传导（Luyt等人，2007）。此外，使用无亚型选择性的激动剂巴氯芬来激活GABA_BR，可以调控体外少突胶质细胞前体的分化过程（Serrano-Regal等人，2020a），还能加速小鼠脊髓在出现原发性脱髓鞘后的再髓鞘化过程（Serrano-Regal等人，2022）。在星形胶质细胞和小胶质细胞中的研究表明，这些胶质细胞也表达GABA_BR1，使用巴氯芬激活它们后，对脂多糖的炎症反应会减弱（Charles等人，2003；Kuhn等人，2003；Lee等人，2011）。有研究在血管内皮细胞中也发现了功能性的GABA_BRs，它们可以调节细胞对同型半胱氨酸毒性的反应（Shastry等人，2006）。虽然有些研究检测到了GABA_BR1的两种亚型，但目前尚不清楚胶质细胞是否更倾向于表达某种特定的亚型。

在阿尔茨海默病发病过程中，GABA_BR的水平会发生变化。在人类大脑中，海马区的GABA_BR1水平会以与布拉克分期相关的方式暂时上升，这表明这种变化可能是一种代偿机制（Iwakiri等人，2005）。此外，在APP/PS1阿尔茨海默病小鼠模型中进行的检测显示，在与该模型认知功能障碍相对应的年龄阶段，海马区所有GABA_BR亚型的水平都会下降（Iwakiri等人，2005；Martín-Belmonte等人，2020a；Martín-Belmonte等人，2020b）。不过，目前还不清楚这些变化是否发生在特定的细胞类型中，也不清楚它们是否具有亚型特异性。

在本研究中，我们提供了来自同一只小鼠大脑的少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞、星形胶质细胞和神经元中APP的细胞类型特异性表达谱（Houmam等人，2025）。此外，我们还在正常情况下以及APP NL-G-F阿尔茨海默病转基因小鼠模型中，使用RT-qPCR技术检测了这五种细胞类型中GABA_BR RNA的亚型特异性表达情况。了解大脑不同细胞群体中GABA_BR表达的细胞类型和亚型特异性变化，对于弄清GABA_BR信号通路如何影响大脑功能以及阿尔茨海默病的病理机制至关重要。

章节节选

少突胶质细胞中的APP RNA水平最高

APP在整个人脑中都有广泛表达，但其在不同细胞类型中的相对表达水平以及这种表达的意义至今仍未得到充分研究。我们在两个公开的数据集中检测了APP（基因名为App）的相对RNA表达情况。第一个数据集是由Allen等人（2023）在年轻（4周龄）和年老（90周龄）小鼠身上生成的单细胞RNA测序数据集。在该数据集中，App在少突胶质细胞和内皮细胞中高度富集，其次是神经元（图1A）。这

讨论

虽然已有大量研究记录了APP在多种大脑细胞类型中的表达情况，但它在不同非神经元细胞类型中的表达程度及其功能意义仍需进一步探究。我们的研究结果证实，APP不仅存在于神经元中，也存在于少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和星形胶质细胞中。我们发现APP在少突胶质细胞中的表达水平最高，而这类细胞至今仍缺乏足够的研究。APP及其裂解片段似乎能够调节

关键资源表

试剂或资源	来源	标识符
重要商业检测试剂
RNeasy试剂盒	QIAGEN	74,104
带RNA酶抑制剂的Applied Biosystems高容量cDNA逆转录试剂盒	Applied Biosystems	4,374,966
TaqMan基因表达主混合液	Applied Biosystems	4,369,016
实验模型：生物/品系
C57BL/6J小鼠	杰克逊实验室	品系编号#000664
APP基因敲除小鼠	杰克逊实验室	品系编号#004133
GABABR1a基因敲除小鼠	比利时鲁汶VIB-库鲁汶脑与疾病研究中心	无
APP NL-G-F小鼠	日本理化学研究所脑科学研究中心

利益冲突声明：

H.C.R.是关于APP与GABA_BR相互作用的专利的发明人，该专利归VIB（佛兰德斯生物技术研究所）和库鲁汶大学所有：专利编号WO2018015296A1，名称为“用于治疗神经和精神障碍的药物”。其他作者不存在需要披露的利益冲突。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（授予H.C.R.的R35GM142726、R21AG085486、P20GM125528项目，以及授予S.H的T32AG052363项目）和长老会健康基金会的支持（向H.C.R.提供的试点研究资金）。数据处理和分析工作得到了OMRF生物医学数据科学中心的支持。我们还要感谢OMRF流式细胞术实验室，以及Rice、Freeman、Oca?as和Miller实验室的成员们，他们在我们研究中给予了很多帮助。同时，我们也要感谢Freeman实验室允许我们使用MACSOctodissociator设备。