《Comparative Immunology Reports》：Extracellular Vesicle Signatures are modified in Haemolymph of Atlantic Rock Crab (Cancer irroratus) infected with Shell Disease – a Study from Icelandic Waters
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甲壳类壳病（Shell Disease）的特征是几丁质外骨骼的降解，随后微生物入侵和败血性感染（septicaemic infections），这些可由环境应激源（包括温度波动和污染物）加剧。最近关于冰岛水域大西洋岩蟹（Cancer irroratus）壳病的
甲壳类壳病（Shell Disease）的特征是几丁质外骨骼的降解，随后微生物入侵和败血性感染（septicaemic infections），这些可由环境应激源（包括温度波动和污染物）加剧。最近关于冰岛水域大西洋岩蟹（Cancer irroratus）壳病的研究引起了对该非本地物种对本地生态系统潜在影响的重大关注。因此，增加对与壳病相关的细胞通讯机制的理解是重要的。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）通过细胞间传递各种货物在细胞通讯中发挥关键作用，可从生物体液中分离。为了研究C. irroratus壳病中EV通讯改变的系统性反应，本研究评估了感染和未感染的雄性和雌性蟹的血淋巴EV谱，包括蛋白质组内容。基因本体论（Gene Ontology, GO）和Reactome通路富集分析将蟹血淋巴EV蛋白货物与一系列免疫、细胞通讯、膜运输、囊泡介导的运输、细胞周期、信号转导、转录调控以及DNA损伤和修复反应通路相关联。总体而言，鉴定出34种蛋白，观察到一些性别差异。仅在感染雄蟹EV货物中鉴定出的两种蛋白是α-2-巨球蛋白（alpha-2-Macroglobulin），具有关键先天免疫功能，以及肌动蛋白-1（actin-1），在免疫和细胞通讯中具有多方面作用。仅在感染雌蟹EV蛋白货物中鉴定出的三种蛋白是Enkurin结构域蛋白（Enkurin domain containing protein），在细胞周期和DNA修复中起作用；核糖体蛋白Lu5（ribosomal protein Lu5），在翻译、代谢和RNA加工中起作用；以及盘状脂蛋白和β-葡聚糖结合蛋白（Discoidal lipoprotein and beta-glucan binding protein），作用未明。与未感染个体相比，感染壳病的雄蟹血淋巴中EV浓度升高，并且基于纳米颗粒追踪分析和单分子定位超分辨率显微镜成像，观察到雄性和雌性蟹之间对感染反应的EV亚群动态的一些变化。这些发现为使用血淋巴EV作为监测海洋贝类疾病反应的生物标志物铺平了道路，并具有研究全球入侵海洋物种疾病流行的转化潜力。
甲壳类壳病（Shell Disease）是全球多种甲壳动物普遍存在的疾病，以几丁质外骨骼降解为特征，涉及自然行为（如争斗、捕食）和环境应激源（如温度波动、污染物）的初始损害，随后由几丁质分解微生物导致渐进性外骨骼退化，并可能引发细菌和真菌入侵及败血性感染。近年来，在冰岛水域发现的大西洋岩蟹（Cancer irroratus）壳病引起了广泛关注，因为这种非本地物种对本地生态系统（包括其他贝类）可能产生重大影响，其病理生理机制尚不完全清楚。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通讯的关键媒介，可携带蛋白质、RNA等货物，在生理和病理过程中发挥多面作用，且可从血淋巴等生物体液中分离。鉴于EV在甲壳动物健康和疾病监测中的潜力日益被认可，研究人员开展了这项研究，旨在评估C. irroratus壳病状态下血淋巴EV特征的改变，包括性别特异性差异，为疾病监测和入侵物种流行病研究提供新的生物标志物。该论文发表在《Comparative Immunology Reports》。
研究人员采用以下关键技术方法（不超过250字）：样本来源于冰岛Hvalfj?reur五个采样点（S1-S5）的陷阱捕捞，根据壳损伤评分（基于分布和强度）将蟹分为感染和未感染组，并控制体长和蜕皮周期，最终用于分析的是雄蟹20只/组、雌蟹10只/组。主要技术包括：通过差速离心和超速离心分离血淋巴EV；利用纳米颗粒追踪分析（NTA）量化EV浓度和大小分布，并区分小EV（≤100 nm）、中EV（101-200 nm）和大EV（>200 nm）；使用透射电子显微镜（TEM）观察EV形态；应用直接随机光学重建显微镜（dSTORM）成像，结合磷脂酰丝氨酸（PS）捕获和荧光标记抗体（抗CD9+CD63+CD81四旋蛋白三组及pan-EV标志物）进行单分子定位超分辨率分析；通过Western blotting（WB）检测CD63和Flotillin-1标志物；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定EV蛋白货物，并通过STRING数据库（基于Penaeus vannamei）进行蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络和基因本体论（GO）及Reactome通路富集分析。
研究结果部分：
**感染和未感染蟹血淋巴EV的谱分析**：通过NTA分析，所有组别EV大小分布为40-400 nm，主要集中于100-200 nm。感染雄蟹的EV浓度有升高趋势（p=0.07），中等大小EV（101-200 nm）比例显著增加（p≤0.01）。感染雌蟹的小EV比例减少，大EV比例增加，但统计学不显著。dSTORM成像显示，感染雄蟹的双阳性（pan-EV和TT）EV密度有增加趋势，感染雌蟹的TT阳性EV密度显著降低（p≤0.05）。WB确认了CD63和Flotillin-1阳性。这些结果表明，感染导致EV亚群动态改变，且存在性别差异。
**感染与未感染雄性和雌性蟹EV蛋白货物及通路富集比较**：LC-MS/MS共鉴定34种蛋白，其中15种在STRING数据库（基于Penaeus vannamei）中可进一步分析。共享蛋白包括血蓝蛋白（Hemocyanin）亚基1-5、隐蓝蛋白（Cryptocyanin）、C型凝集素（C-type lectin）、肌动蛋白（Actin）、RNA指导的DNA聚合酶等。通路富集分析（Reactome）揭示了39条通路，涉及间隙连接形成、细胞-细胞通讯、DNA损伤修复、VEGF信号、肌动蛋白动力学调控、吞噬作用、网格蛋白介导内吞、MAPK通路、RHO GTPase通路、止血、蛋白代谢等。这些发现表明EV蛋白货物在免疫和细胞通讯中发挥多面作用。
**仅在感染雄蟹EV中鉴定的蛋白货物**：感染雄蟹EV中有两个独特蛋白：α-2-巨球蛋白（Alpha-2-macroglobulin）和肌动蛋白-1（Actin-1）。通路分析显示，α-2-巨球蛋白与先天免疫、补体激活、血小板信号、细胞外基质组织、转录调控、DNA损伤修复相关；肌动蛋白-1与细胞骨架组织、免疫系统功能、FCGR依赖性吞噬、网格蛋白介导内吞、RHO GTPase通路、囊泡运输等关联。这些蛋白可能参与感染后的免疫应答和细胞通讯。
**仅在感染雌蟹EV中鉴定的蛋白货物**：感染雌蟹EV中有四个独特蛋白：盘状脂蛋白和β-葡聚糖结合蛋白（Discoidal lipoprotein and beta-glucan binding protein）、核糖体大亚基蛋白uL5（Ribosomal protein uL5）、Enkurin结构域蛋白（Enkurin domain containing protein）及一个未表征蛋白。其中Enkurin结构域蛋白与DNA生物合成、修复、细胞周期调控及端粒维持相关；核糖体蛋白uL5与细胞质翻译、核糖体加工及RNA代谢相关。盘状脂蛋白和β-葡聚糖结合蛋白的功能尚未明确，但可能参与脂质运输和免疫应答。这些结果提示雌蟹对感染的反应涉及不同的分子机制。
讨论部分总结：本研究首次报道了大西洋岩蟹EV对壳病的响应，观察到EV数量和亚群的性别特异性变化，并鉴定了差异表达的EV蛋白货物。尽管存在样本量限制、抗体交叉反应性及数据库依赖等局限性，但这些发现表明血淋巴EV可作为监测壳病及环境变化的潜在生物标志物。结论翻译如下：本研究首次分析了大西洋岩蟹（C. irroratus）血淋巴EV特征对壳病的响应，评估了雄性和雌性蟹，观察到了某些性别差异。感染壳病的雄蟹血淋巴中EV数量略有升高，EV亚群也发生了变化。通过SDS-PAGE和银染以及蛋白质组学分析，雄性和雌性蟹的EV蛋白货物均发生改变，其中感染雌蟹组鉴定出更多蛋白。总体而言，蟹血淋巴EV蛋白货物与多种细胞通讯和免疫通路相关。仅在感染雄蟹EV中鉴定出的两种蛋白是α-2-巨球蛋白（具有关键先天免疫功能）和肌动蛋白-1（在免疫和细胞通讯中具有多方面作用）。仅在感染雌蟹EV中鉴定出的三种特异性蛋白是Enkurin结构域蛋白（在DNA修复和细胞周期中发挥作用）、核糖体蛋白Lu5（在翻译、代谢和RNA加工中发挥作用）以及盘状脂蛋白和β-葡聚糖结合蛋白（功能未明）。尽管本研究支持血淋巴EV作为疾病相关指标的潜力，但将其作为实用生物标志物尚需在更大队列中进一步验证，并评估个体变异、疾病阶段以及其他环境或感染性应激源的影响。这些发现为使用血淋巴EV作为海洋贝类疾病监测和环境变化评估的生物标志物铺平了道路。
