《Cytotherapy》：Sequential CD2/CD3/CD28 activation improves non-viral large-payload CAR knock-in at the TRAC locus
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魏文|李翔|刘彤|张书曼|孙迪|赵西蝶|程崇岩|张黎明|张建平|张晓冰中国医学科学院血液病医院血液病学与血液疾病研究所、国家血液疾病临床研究中心、海河细胞生态系统实验室，天津摘要CRISPR/Cas9通过同源定向修复实现非病毒靶向整合，为生成均匀的下一代CAR-T细胞提供了方法，
魏文|李翔|刘彤|张书曼|孙迪|赵西蝶|程崇岩|张黎明|张建平|张晓冰
中国医学科学院血液病医院血液病学与血液疾病研究所、国家血液疾病临床研究中心、海河细胞生态系统实验室，天津
摘要
CRISPR/Cas9通过同源定向修复实现非病毒靶向整合，为生成均匀的下一代CAR-T细胞提供了方法，同时避免了病毒载体带来的风险。然而，将大型治疗性负载高效递送至原始T细胞仍受限于较低的HDR效率以及电穿孔引发的毒性。本研究显示，在AZD7648支持的非病毒编辑框架下，依次激活CD2/CD3/CD28可提高TRAC位点的HDR介导的大负载基因敲入效率，并增加存活的CAR-T细胞产量。转录组分析及线粒体膜电位检测表明，这种处理方式与细胞周期和代谢相关过程有关，可能有助于提升细胞对电穿孔应激的耐受性以及处理大型DNA模板的能力。功能实验显示，经过工程改造的非病毒TRAC-CD19.CAR-T细胞在体外具有抗原特异性细胞毒性，且在NSG异种移植模型中能够抑制白血病进展，其抗肿瘤活性接近该模型中慢病毒CAR-T细胞的水平。本研究确立了一种优化的顺序激活策略，可提升非病毒大负载TRAC靶向CAR-T细胞的工程化效率，有望为未来精准细胞免疫疗法的制造流程开发提供参考。
章节节选
引言
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已显著改变了复发难治性血液系统恶性肿瘤的治疗方案[1,2]。目前，经FDA批准的CAR-T产品的临床生产主要依赖慢病毒和γ逆转录病毒等病毒载体[3]。尽管这些病毒载体效率很高，但存在诸多局限性：存在致癌插入突变的风险，由于基因组整合具有半随机性，会导致CAR表达不均匀，同时还存在其他限制
负载大小与细胞活力限制了原始T细胞中的非病毒HDR技术应用
CRISPR/Cas9通过同源定向修复实现转基因的靶向插入，是非病毒CAR-T细胞工程的重要策略。然而，通过电穿孔将大型双链DNA模板高效递送并整合到原始人类T细胞中仍然面临挑战，这往往会导致基因敲入效率下降以及细胞存活率降低[13]。
浓度在6到24 pmol之间的RNP输入可在TRAC位点以及其它位置实现高效的基因破坏
讨论
研发经过精准设计的嵌合抗原受体（CAR）T细胞，对于制备均匀、生理调控良好且具备临床应用价值的细胞疗法至关重要[30]。近年来，基于非双链断裂的长负载插入策略取得了进展，包括四聚pegRNA、PRIME-In以及prime assembly（PA）等方法，这些方法为整合长度达10 kb的DNA模板提供了新途径[[31], [32], [33]]；不过，这些技术仍较为复杂，还需进一步优化
原始人类T细胞的分离与培养
研究所需的新鲜全血是从天津血液中心获取的，相关操作已获得海河细胞生态系统伦理委员会的伦理批准（批准号HH-TJ20250009-EC-1）。通过使用Ficoll-Paque（浓度为1.077 g/mL）进行密度梯度离心，从新鲜全血中分离出了人类外周血单核细胞（PBMCs）。随后，按照制造商的说明，使用MaxSortin? CD3磁选珠（T&L Biotechnology，型号TL-662）对原始人类T细胞进行了富集
数据可用性
本研究生成的RNA测序数据已存储在NCBI序列读取档案库（SRA）中，登录号为PRJNA1454887，论文发表后将向公众开放；如需，也可为审稿人提供访问权限。本研究生成的质粒也会在收到合理请求后提供给相应作者。作者确认，本文及其补充材料中包含所有必要的支持数据。
作者贡献
魏文负责该研究的构思与设计，开展实验、分析数据并撰写论文。李翔、刘彤、赵西蝶和张书曼负责动物实验工作。孙迪负责生物信息学分析。程崇岩和张黎明负责载体克隆工作。张建平和张晓冰负责项目监督并参与论文撰写。所有作者都对论文内容进行了审核。
关于论文准备过程中生成式AI及AI辅助技术的声明
在准备这篇论文的过程中，作者使用了OpenAI开发的ChatGPT工具，协助优化图形摘要的视觉布局、文字表述以及图形呈现方式。图形摘要的科学概念、实验逻辑和核心思想均由作者自行构建。作者根据需要对输出内容进行审核和修改，并对最终发表文章的内容承担全部责任。
