TLR9（Toll样受体9）促进食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）的肿瘤进展及顺铂（cisplatin）耐药

《Genes & Diseases》：TLR9 contributes to tumor progression and cisplatin resistance in esophageal squamous cell carcinoma

　　

摘要：食管鳞状细胞癌（ESCC）因其高侵袭性和转移潜能而致死率高，但其进展的分子机制尚不清楚。尽管TLR9（Toll-like receptor 9，Toll样受体9）高表达与ESCC不良预后相关，但TLR9在ESCC细胞中的功能与调控机制仍不明确。研究人员通过分析ESCC组织队列及TCGA_ESCC数据库，结合质谱与RNA测序探究TLR9功能机制，并经体外及体内实验验证。结果发现TLR9促进ESCC细胞运动能力并介导顺铂（cisplatin）耐药。机制上，TLR9通过NF-κB信号通路激活上皮–间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）。蛋白质组学分析显示TLR9激动剂（agonist）处理可模拟TLR9过表达对EMT的激活作用，而TLR9抑制剂（inhibitor）可抑制TLR9诱导的EMT活化。TCGA_ESCC数据库及miRNA数据库分析揭示TLR9 mRNA分别受SPI1（转录因子PU.1）正向调控及miR-574-5p负向调控，即存在SPI1介导的正向调控及顺铂/IRF1（interferon regulatory factor 1，干扰素调节因子1）/miR-574-5p介导的负向调控两条新调控途径。顺铂联合TLR9抑制剂可显著延长荷瘤小鼠生存期。本研究揭示了TLR9在ESCC中的新功能与调控机制，提示TLR9可作为预测ESCC患者预后及评估顺铂化疗敏感性的生物标志物（biomarker），靶向TLR9可能是ESCC潜在治疗策略。

论文解读：TLR9促进食管鳞状细胞癌进展及顺铂耐药的机制研究

一、研究背景与概述

食管癌（esophageal cancer, EC）是全球高发恶性肿瘤，其中食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）占90%，中国尤其高发，5年生存率不足30%。ESCC高侵袭、早期淋巴结转移且顺铂（cisplatin）化疗易产生耐药，但其分子机制不明。Toll样受体9（Toll-like receptor 9, TLR9）在多种肿瘤高表达并与不良预后相关，但在ESCC细胞中TLR9的功能、上下游调控及能否作为治疗靶点缺乏系统研究。本文由Xiang Dongfang等发表于《Genes & Diseases》（西南医院/陆军军医大学团队完成），研究人员通过临床标本、生物信息学、蛋白质组/转录组及体内外功能实验，阐明TLR9经NF-κB–EMT轴促ESCC进展与顺铂耐药，受CCL4–SPI1正向及顺铂/IRF1/miR-574-5p负向调控，并证实TLR9抑制剂羟氯喹（hydroxychloroquine, HCQ）联合顺铂可增敏抑瘤，为ESCC的预后判断与联合治疗提供新依据。

二、主要关键技术方法

研究人员收集133例ESCC及配对癌旁正常组织、转移淋巴结和20例新鲜标本建临床队列；利用免疫组化（IHC）、qRT-PCR检测TLR9蛋白/mRNA水平并行Kaplan–Meier生存与Cox回归分析。构建TLR9过表达/敲低ESCC稳转株（EC109、KYSE150），行MTT/BrdU、划痕、Transwell侵袭、体内皮下成瘤及尾静脉肺转移模型验证功能。通过定量质谱（quantitative mass spectrometry）与RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）分析差异蛋白与通路（DAVID、GSEA），Western blot检测NF-κB与EMT标志。双荧光素酶报告实验验证SPI1结合TLR9启动子及miR-574-5p靶向TLR9 3′-UTR；用shRNA敲低SPI1、miR-574-5p mimic过表达、重组CCL4/Met-RANTES干预验证CCL4–SPI1轴；用顺铂处理及IRF1启动子报告验证顺铂/IRF1/miR-574-5p负调控轴。建立顺铂耐药细胞株，MTT测IC₅₀，CompuSyn分析HCQ与顺铂联用协同指数（combination index, CI），小鼠移植瘤模型评估单药与联合疗效及生存。

三、研究结果

TLR9 is a biomarker for disease progression and poor survival in ESCC（TLR9是ESCC疾病进展和不良生存的生物学标志物）

通过对133例ESCC组织的IHC分析，TLR9蛋白在正常食管上皮几乎不表达，在ESCC原发灶、深浸润及淋巴结转移灶高表达；mRNA随临床分期（Ⅰ→Ⅲ）升高。TLR9高表达与肌层浸润、淋巴结转移、TNM分期显著相关，与患者性别、年龄、分化无关。高TLR9组总生存期（overall survival, OS）显著短于低表达组，Cox多因素分析显示高TLR9是ESCC独立预后指标（HR=0.568, P=0.031）；TCGA_ESCC数据验证相同趋势。TLR9过表达EC109细胞皮下成瘤小鼠生存期缩短、瘤体增大，证实TLR9预示ESCC进展与不良预后。

TLR9 acts as an oncogene in ESCC with the activation of epithelial–mesenchymal transition (EMT)（TLR9在ESCC中发挥癌基因作用并通过激活上皮–间质转化实现）

TLR9过表达促进EC109与KYSE150细胞增殖（BrdU、MTT）及迁移、侵袭（划痕、Transwell），TLR9敲低反之；尾静脉注射TLR9敲低细胞后NOD/SCID小鼠肺转移结节减少。定量质谱与RNA-seq显示TLR9过表达上调427个蛋白，GSEA富集到TNFA SIGNALING VIA NF-κB及EMT特征基因集。Western blot证实TLR9过表达上调N-cadherin、Vimentin、Snail，下调E-cadherin，并增加p-p65（NF-κB p65磷酸化）；NF-κB抑制剂JSH-23与QNZ可阻断TLR9诱导的EMT标志改变，表明TLR9经NF-κB信号激活EMT促ESCC恶性表型。

CCL4–SPI1 axis promotes TLR9 transcription in ESCC（CCL4–SPI1轴促进ESCC中TLR9转录）

TCGA_ESCC中TLR9 mRNA与各候选转录因子相关性分析显示SPI1（PU.1）与TLR9相关性最强。荧光素酶报告提示TLR9启动子近端SPI1结合基序（–45～–40）对转录更重要。shRNA敲低SPI1显著降低TLR9 mRNA及蛋白水平，并削弱TLR9与MyD88（myeloid differentiation primary response 88）共定位。TCGA分析高SPI1预示ESCC不良预后。细胞因子相关性筛选发现CCL4（C-C motif chemokine ligand 4）与SPI1高度正相关且与CCR1/CCR5受体共相关；CCL4高/CCR1高亚组SPI1、TLR9表达更高且二者正相关。重组CCL4刺激上调ESCC细胞SPI1及TLR9，CCR1/CCR5拮抗剂Met-RANTES可阻断该效应，确立CCL4–SPI1为TLR9正向转录调控轴。

MiR-574-5p provides an alternative regulation mechanism for TLR9 expression in ESCC（MiR-574-5p为ESCC中TLR9表达的另一种调控机制）

四个miRNA数据库交集仅miR-574-5p预测靶向TLR9 3′-UTR。qRT-PCR示miR-574-5p在ESCC组织中显著低于癌旁，且随分期进展下调。双荧光素酶报告：miR-574-5p mimic降低含野生型TLR9 3′-UTR报告活性，突变结合位点则无影响。过表达miR-574-5p mimic降低TLR9蛋白并抑制ODN2006（CpG寡脱氧核苷酸）诱导的TLR9–MyD88共定位，证明miR-574-5p负向转录后调控TLR9。

High TLR9 expression renders ESCC cells resistant to cisplatin（高TLR9表达致ESCC细胞顺铂耐药）

MTT显示TLR9过表达细胞顺铂IC₅₀升高（EC109：8.46 μM vs 2.81 μM；KYSE150：6.19 μM vs 1.67 μM）；体内顺铂可抑制对照细胞移植瘤但对TLR9过表达瘤体无效。诱导的顺铂耐药EC109细胞（EC^Resist）TLR9蛋白升高，GSEA示DNA REPAIR与EMT富集且与TLR9过表达特征重叠。顺铂处理剂量依赖性地下调TLR9 mRNA/蛋白及TLR9–MyD88互作，但不改变SPI1，而上调miR-574-5p。miR-574-5p启动子含IRF1（interferon regulatory factor 1）结合位点，顺铂诱导IRF1表达，缺失该位点报告活性降约30%，证实顺铂经IRF1↑→miR-574-5p↑→TLR9↓负反馈抑制TLR9，而基础高TLR9介导顺铂耐药。

Cisplatin and TLR9 inhibitor synergistically suppress ESCC growth（顺铂与TLR9抑制剂协同抑制ESCC生长）

TLR9激动剂CpG-ODN（ODN）处理模拟TLR9过表达富集EMT与NF-κB通路，TLR9抑制剂羟氯喹（HCQ）反之抑制之。MTT联用分析显示HCQ与顺铂在ESCC细胞具协同抑活作用（CI<1），ODN无协同。皮下移植瘤模型中顺铂+HCQ比单药更显著抑制肿瘤体积增长并延长小鼠生存期，证实靶向TLR9（抑制而非激活）可逆转顺铂耐药。

四、讨论与结论总结

研究人员讨论指出，TLR9在ESCC中发挥癌基因作用，其高表达与侵袭、转移及顺铂耐药相关，机制为CCL4–SPI1转录激活TLR9及顺铂/IRF1/miR-574-5p负调控TLR9，TLR9经MyD88–NF-κB信号激活EMT促恶性表型。既往临床试验将TLR9激动剂与顺铂联用失败，本研究首次证明TLR9抑制剂（如HCQ）联合顺铂可协同抑瘤，为TLR9高表达ESCC提供了化疗增敏新策略。TLR9及循环miR-574-5p有潜力作为ESCC预后及顺铂反应的非侵入性生物标志物。

结论（翻译）：综上，本研究揭示了TLR9在ESCC中的功能与调控新机制，确定TLR9可作为ESCC疾病进展、不良预后及顺铂耐药的潜在生物标志物，其可能通过NF-κB介导的上皮–间质转化发挥作用。此外TLR9受CCL4–SPI1轴正向调控。因此，阻断TLR9功能值得在ESCC治疗中进行进一步研究探索。