《Frontiers in Neurology》：Potential neuroprotective and anticonvulsant effects of Ganoderma lucidum ethanol extract and its impact on affective comorbidities associated with pentylenetetrazol kindling model of epilepsy: behavioral, biochemical and histological studies
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摘要：癫痫是一种受氧化应激和神经元死亡两大病理生理因素强烈影响的慢性神经系统疾病。近年多项研究表明灵芝(Ganoderma lucidum)提取物（Ganoderma lucidum extract, GLE）可能具有抗氧化特性，但其治疗癫痫有效性的证据有限。
摘要：癫痫是一种受氧化应激和神经元死亡两大病理生理因素强烈影响的慢性神经系统疾病。近年多项研究表明灵芝(Ganoderma lucidum)提取物（Ganoderma lucidum extract, GLE）可能具有抗氧化特性，但其治疗癫痫有效性的证据有限。本研究探讨GLE（300 mg/kg）对戊四氮（pentylenetetrazol, PTZ, 35 mg/kg）诱发惊厥的神经保护作用。将32只雄性Wistar大鼠随机分为4组（n=8/组）：对照组、PTZ组、GLE-300组及地西泮(Diazepam)组。每48 h腹腔注射PTZ（35 mg/kg，共11次）持续21 d建立癫痫模型，采用Racine五级评分评估惊厥严重程度；通过旷场实验（open field test, OFT）和高架十字迷宫（elevated plus maze test, EPMM）评估焦虑行为、运动及探究活动，强迫游泳实验（forced swim test, FST）评估抑郁样行为；采用硫代巴比妥酸法（thiobarbituric acid, TBA）测定丙二醛（malondialdehyde, MDA）、格里斯试剂法测定一氧化氮（nitric oxide, NO）、氮蓝四唑（nitro blue tetrazolium, NBT）还原法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性、过氧化氢分解法测定过氧化氢酶（catalase, CAT）活性；Nissl染色定量前额叶皮层（prefrontal cortex, PFC）各层神经元丢失情况。结果显示，GLE可显著降低癫痫诱导过程中的惊厥严重程度（p < 0.001），缓解焦虑（p = 0.005）和抑郁（p = 0.008）行为并减轻神经元损伤；生化检测中显著下调NO和MDA水平（p < 0.001），恢复CAT（p = 0.005）和SOD（p = 0.010）酶活性；组织学上GLE因其抗氧化和神经保护特性减少了PFC神经变性（p = 0.003）。综上，实验结果表明GLE可显著减弱PTZ诱导的行为学、生化及组织学改变，支持其在PTZ点燃癫痫模型中的神经治疗潜力。
本研究发表于《Frontiers in Neurology》。癫痫是全球常见的慢性神经系统疾病，其发病机制尚未完全阐明，反复癫痫发作源于兴奋—抑制信号失衡并导致神经元变性。约30%—50%的癫痫患者伴有焦虑、抑郁等情感共病，且前额叶皮层（prefrontal cortex, PFC）在调节皮层兴奋性及情感功能中起关键作用。癫痫病理过程中氧化应激——表现为脂质过氧化产物丙二醛（malondialdehyde, MDA）和一氧化氮（nitric oxide, NO）升高，以及抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和过氧化氢酶（catalase, CAT）活性下降——是促发神经元损伤和癫痫发作的重要机制。传统抗癫痫药物存在耐药或精神副作用，天然产物灵芝（Ganoderma lucidum）含三萜类（如灵芝酸ganoderic acids）、多糖及酚类化合物，已有报道具抗氧化、调节钙离子及抑制凋亡通路作用，但在PTZ点燃癫痫模型中对惊厥控制及情感共病的系统性评价尚缺。为此，研究人员假设灵芝乙醇提取物（Ganoderma lucidum ethanol extract, GLE）可通过抗氧化及神经保护机制减轻PTZ点燃诱导的惊厥、情感障碍及PFC神经元损伤，并设计动物实验加以验证。
主要技术方法概述
研究人员选用成年雄性Wistar大鼠（n=8/组，共4组：对照组、PTZ模型组、GLE预处理+PTZ组、地西泮阳性药对照+PTZ组），GLE以300 mg/kg每日灌胃预处理21 d，PTZ以35 mg/kg每48 h腹腔注射共11次建立点燃模型。末次PTZ注射24 h后依次进行高架十字迷宫（EPM）、旷场实验（OFT）及强迫游泳实验（FST）评估焦虑与抑郁样行为；行为学测试后取脑分离PFC，匀浆后检测MDA、NO、SOD及CAT活性；另取脑组织经心脏灌注固定、切片行Nissl染色观察PFC（皮层Ⅱ/Ⅲ及V层）存活神经元数量。数据经Shapiro-Wilk正态检验后以单因素方差分析（one-way ANOVA）或双因素方差分析（two-way ANOVA）联合Tukey事后检验处理，p<0.05为差异有统计学意义。
研究结果
Effect of GLE supplementation and diazepam treatment on the severity of convulsive seizures during the kindling process：PTZ组Racine评分从第1天平均1.63升至第21天4.88（全身性强直—阵挛发作），GLE-300组最高评分3.75±0.25，显著低于PTZ组（p<0.001），仅1只达5级；地西泮组几乎无点燃进展。表明GLE预处理可延缓并减轻PTZ点燃过程中的惊厥严重程度。
Effect of GLE pre-treatment on affective function——GLE'S impact on EPM'S anxious behavior：PTZ组开放臂进入次数（entries in open arms, EOA）和时间（time spent in open arms, TOA）较对照组显著降低（p<0.001），GLE-300组EOA（p=0.005）和TOA（p<0.001）较PTZ组显著升高，具抗焦虑效应。——GLE'S impact on anxiety-like conduct during the open-field test：PTZ组中心区返回次数（number of returns to the center, NRC）及停留时间（time spent in the central area, TCA）下降，GLE-300组TCA较PTZ组显著延长（p=0.005），同样显示抗焦虑作用。——Rats exposed to PTZ-induced kindling in the FST: the impact of GLE：PTZ组不动时间（immobility time）较对照组升高（p<0.001），GLE-300组不动时间较PTZ组缩短（p=0.008），提示GLE可减轻PTZ点燃诱发的抑郁样行为。
Effects of repeated administration of GLE and diazepam on oxidative stress parameters——NO levels：PTZ组PFC中NO水平较对照组升高（p<0.001），GLE-300组较PTZ组显著降低（p<0.001），但未恢复至对照组水平。——MDA levels：PTZ组MDA升高（p<0.001），GLE-300组较PTZ组显著降低（p<0.001），仍高于对照组。表明GLE部分抑制PTZ诱导的脂质过氧化及NO过量产生。——Catalase activity：PTZ组CAT活性下降（p<0.001），GLE-300组较PTZ组部分回升（p=0.005）。——SOD activity：PTZ组SOD活性降低（p<0.001），GLE-300组较PTZ组部分恢复（p=0.010）。提示GLE可部分重建内源性抗氧化防御。
Histological evaluations：PTZ组PFC存活神经元数较对照组减少（p<0.001），伴细胞排列紊乱、核固缩及胞质深染；GLE-300组存活神经元数较PTZ组增加（p=0.003），神经元形态接近正常。证实GLE减轻PTZ所致PFC神经退行性改变。
讨论与结论
研究人员指出，PTZ点燃模型可重现慢性全身性癫痫及伴随的情感共病，其机制涉及GABA能/谷氨酸能失衡及氧化应激。GLE所含三萜类（如ganoderic acid A）及多糖可能通过调节Ca2+、抑制促凋亡通路及增强抗氧化酶，减轻兴奋性毒性并部分恢复GABA/谷氨酸平衡。本研究中GLE虽未完全阻止全面性发作，但显著延缓点燃进程、改善焦虑—抑郁样行为、降低MDA与NO、恢复SOD与CAT活性、减少PFC神经元丢失，作用机制与抗氧化及神经保护相关。地西泮虽强效抗惊厥但仅作用于GABAA受体且长期使用可致耐受，对氧化应激及神经元死亡无直接拮抗；而GLE展现多靶点调节潜力。局限性在于GLE未能完全恢复正常参数，且未直接测定GABA/谷氨酸浓度及各单体成分贡献，需进一步研究。
结论翻译：本研究表明，在点燃过程中PFC前边缘皮层出现神经行为学、神经化学及组织病理学改变；GLE在PTZ诱导的点燃模型中发挥抗惊厥、抗氧化及神经保护作用，从而减轻焦虑—抑郁相关改变，该效应与降低PFC氧化损伤相关。因此，GLE可能有助于维持参与情感调节的皮层区域氧化还原平衡及神经元功能。
