《Frontiers in Endocrinology》：Serum and serum-derived extracellular vesicle microRNA signatures linked to neurodevelopmental processes in central precocious puberty
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背景：中枢性性早熟（CPP）是由于下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴过早激活引起的。虽然青春期启动的激素机制已明确，但伴随青春期时序改变的分子调控过程仍不完全清楚。循环microRNA（miRNA）可游离存在或包装于细胞外囊泡（EV）中，代表了与青春期发育相关的转
背景：中枢性性早熟（CPP）是由于下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴过早激活引起的。虽然青春期启动的激素机制已明确，但伴随青春期时序改变的分子调控过程仍不完全清楚。循环microRNA（miRNA）可游离存在或包装于细胞外囊泡（EV）中，代表了与青春期发育相关的转录后调控分子层面。方法：研究人员对诊断为CPP的女性患者及年龄匹配的健康女性对照的血清样本进行小RNA测序，以鉴定差异表达的miRNA。在扩展队列中，研究人员利用血清RNA和从血清来源EV中分离的RNA，通过定量实时PCR（RT-qPCR）对选定的miRNA进行验证。功能性富集分析使用实验验证的miRNA靶基因进行。结果：小RNA测序鉴定了10个在CPP中表达水平显著改变的miRNA（校正p值<0.05，|log2FC|>0.5）。通路富集分析突出了与神经发育、生长调控和细胞成熟相关的生物学过程。RT-qPCR验证确认CPP患者血清中miR-125a-5p、miR-125b-5p和miR-99b-5p表达降低。所有选定的miRNA均在血清来源EV中可检测到。值得注意的是，miR-148a-3p在CPP样本的EV相关组分中表现出统计学显著增加。结论：本研究对女性CPP患者的循环miRNA谱进行了全面分析。游离循环和EV相关miRNA的协调改变突显了miRNA介导的调控对HPG轴过早激活的潜在贡献，并为进一步研究青春期疾病背后的分子机制提供了框架。
**论文解读：血清与血清来源细胞外囊泡microRNA特征在中枢性性早熟神经发育过程中的关联**
**研究背景与科学问题**
青春期是儿童向性成熟过渡的关键发育阶段，其启动依赖于下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的重新激活，表现为促性腺激素释放激素（GnRH）的脉冲式分泌，进而刺激黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的释放，驱动性腺成熟及性类固醇生成。尽管经典内分泌调控机制已较为明确，但青春期时序的精确分子调控网络仍不完全清楚。中枢性性早熟（CPP）是指因HPG轴过早激活导致8岁前出现第二性征的女性疾病，主要发生于女孩。CPP与不良生物学、心理社会和长期健康结局（尤其是生殖发育异常）相关，因此阐明其病理生理的调控机制具有重要临床意义。遗传学研究已发现KISS1、KISS1R、MKRN3和DLK1等基因突变与CPP相关，而表观遗传调控（尤其是microRNA介导的转录后调控）被认为是青春期时序调节的关键新层面。循环microRNA（miRNA）可游离存在于血清或包装于细胞外囊泡（EV）中，具有稳定性高、可反映起源细胞状态的特点，是潜在的非侵入性生物标志物。然而，既往证据多来自动物模型，人类生理和病理青春期状态下循环miRNA的表达谱尚缺乏系统研究。
**本研究的目的与贡献**
研究人员旨在分析女性CPP患者与年龄匹配健康对照者的循环miRNA表达差异，并评估血清来源EV中miRNA的分布特征，以揭示CPP相关的分子调控特征。该研究发表于《Frontiers in Endocrinology》。
**主要关键技术方法**
本研究采用多技术整合策略：1）样本队列来源：从塞浦路斯国家生物伦理委员会批准的研究中纳入22例CPP女性患者和18例健康女童对照，所有样本在治疗前采集；2）小RNA测序：对12例CPP患者和12例对照的血清总RNA进行Illumina NextSeq 2000测序，经nf-core/smrnaseq流程比对miRbase数据库，使用DESeq2鉴定差异表达miRNA（校正p<0.05，|log2FC|>0.5）；3）RT-qPCR验证：在扩展队列（CPP n=22，对照n=18）中，使用TaqMan探针对选定miRNA进行定量验证，血清数据以miR-16-5p为内参，EV数据以cel-miR-39为外参；4）EV分离与表征：采用尺寸排阻色谱（SEC）从血清中分离EV，通过透射电镜（TEM）、Western blot（标记CD63、TSG101、Flotillin-1）和校准流式细胞术（检测CD9、CD81及膜染料CFSE）确认EV身份与纯度；5）功能性富集分析：利用multiMir数据库获取实验验证的靶基因，通过clusterProfiler进行GO（基因本体）和KEGG通路富集分析。
**研究结果**
**3.1 CPP患者血清miRNA的差异表达谱**
小RNA测序鉴定出10个表达水平显著改变的miRNA（校正p<0.05），其中6个下调（log2FC<-0.5），4个上调（log2FC>0.5）。聚类分析显示CPP与对照组间血清miRNA表达模式存在清晰区分。探索性相关性分析未发现这些miRNA与Tanner分期、基础LH、雌二醇、游离T4及骨龄/生活年龄比值等临床参数存在显著关联，可能与样本量有限有关。
**3.2 通路富集分析提示与青春期启动相关的神经发育通路**
对差异表达miRNA的实验验证靶基因进行GO生物学过程分析，发现显著富集于神经元突起发育、轴突发生、神经系统发育、胚胎发育等神经发育相关术语，以及蛋白定位、囊泡运输、细胞周期等基础调控过程。KEGG通路分析进一步显示MAPK、mTOR、Hippo、神经营养因子、轴突导向和ErbB等生长与分化信号通路的富集，以及泛素介导的蛋白水解、内吞作用等细胞调控通路。值得注意的是，囊泡运输和内涵体运输相关通路的富集提示EV生物发生与货物分选可能参与其中。
**3.3 选定miRNA的小RNA测序结果验证**
在扩展队列中通过RT-qPCR对hsa-miR-125a-5p、miR-125b-5p、miR-148a-3p和miR-99b-5p进行验证。结果确认miR-125a-5p、miR-125b-5p和miR-99b-5p在CPP患者血清中显著下调，与测序结果一致，且经FDR校正后仍具统计学意义。miR-148a-3p在血清中的变化方向与测序一致但未达显著水平。
**3.4 选定miRNA在血清来源细胞外囊泡中的检测**
所有四种miRNA均在血清来源EV中可检测到。miR-125a-5p和miR-125b-5p在EV中的表达在两组间无显著差异；miR-99b-5p在EV中显示与测序趋势相反的小幅差异。值得注意的是，miR-148a-3p在EV相关组分中于CPP患者中显著上调（约3倍），经FDR校正后仍显著，而其血清水平差异不显著。这提示miR-148a-3p在血清中的差异表达信号主要来源于EV相关组分。EV表征（TEM、Western blot、流式细胞术）确认了分离囊泡的膜结构、标志物富集及无细胞污染；校准流式细胞术显示两组EV平均直径（对照106 nm，CPP 101 nm）和粒径分布高度相似，而EV颗粒浓度在CPP中呈升高趋势但未达统计学意义。
**总结与讨论**
本研究首次系统描绘了女性CPP患者循环miRNA的总体表达特征，鉴定出10个显著改变的miRNA，并验证了miR-125a-5p、miR-125b-5p和miR-99b-5p的血清下调。通路富集分析将这些miRNA的靶基因关联至神经发育、生长调控及细胞成熟过程，与青春期启动的神经内分泌基础相吻合。尤其是miR-125家族在神经元分化中的已知功能，以及miR-99b在RNA代谢和有丝分裂调控中的作用，提示其可能参与加速成熟伴随的转录后调控网络变化。EV相关分析揭示了miR-148a-3p在EV组分中的特异性升高，该miRNA的预测靶基因富集于“子宫内胚胎发育”过程，且已验证靶基因包括青春期抑制性调控因子MKRN3和DLK1，为EV相关miRNA可能参与神经内分泌调控和HPG轴过早激活提供了间接证据。尽管EV浓度在CPP中未显著升高，但EV相关miRNA表达差异可能反映选择性包装、货物装载改变或EV丰度变化。作为观察性研究，本工作定义了CPP相关的循环和EV相关miRNA景观，支持循环miRNA改变作为经典内分泌调控的补充分子层面，并为后续机制研究提供了框架。**研究结论**：本研究对女性CPP患者的循环miRNA谱进行了全面分析。游离循环和EV相关miRNA的协调改变突显了miRNA介导的调控对HPG轴过早激活的潜在贡献，并为进一步研究青春期疾病背后的分子机制提供了框架。
