《Transboundary and Emerging Diseases》：Molecular Detection of Balantioides coli in Pigs Employing the Traditional PCR and a Novel Cross-Priming Amplification-Based Lateral Flow Assay
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结肠小袋纤毛虫（Balantioides coli）是唯一一种对人类与动物健康均具有重要意义的纤毛虫（ciliate）。在动物中，B. coli 主要感染猪。然而，目前关于中国北方山西省猪群中 B. coli 的资料仍然缺乏。山西省面积为156,700?km<
结肠小袋纤毛虫（Balantioides coli）是唯一一种对人类与动物健康均具有重要意义的纤毛虫（ciliate）。在动物中，B. coli 主要感染猪。然而，目前关于中国北方山西省猪群中 B. coli 的资料仍然缺乏。山西省面积为156,700?km2，养猪业是当地重要的农业产业。在本研究中，研究人员采用以β-微管蛋白（β-tubulin）基因为靶标的传统聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）方法，对采集自该省的341份猪粪便样本进行了 B. coli 检测。结果显示，所调查猪群中 B. coli 的总体感染率为75.1%，且其流行率在不同地区之间存在显著差异。在本研究鉴定出的多态性序列中，观察到具有人兽共患潜力的基因型I（genotype I）。此外，研究人员建立了一种交叉引物扩增（cross-priming amplification, CPA）策略辅助的侧向层析免疫分析（lateral flow immunoassay, LFIA）生物传感器，用于检测 B. coli。从扩增到可视化读出，整个过程无需任何特殊仪器即可在63?min内完成。该生物传感器对质粒DNA的检测灵敏度为100?copies/μL，并且可特异性识别 B. coli。诊断性能分析结果表明，该生物传感器能够准确区分 PCR 阳性与阴性的粪便样本。研究结果有助于拓展对猪群中 B. coli 地理分布与遗传多样性的认识，并对控制猪及人群中的 B. coli 感染具有重要意义。同时，本研究为 B. coli 的检测提供了一种新的分子工具，尤其适用于资源受限环境。
该论文发表于《Transboundary and Emerging Diseases》，聚焦猪源结肠小袋纤毛虫（Balantioides coli）的分子流行病学调查与快速检测方法构建。B. coli 是目前已知唯一对人类和动物健康均具有明确意义的纤毛虫，宿主范围广，但猪被认为是其最主要的感染宿主。该寄生虫主要寄生于肠道，经粪—口途径传播，生活史包括滋养体和包囊两个阶段，其中包囊是主要感染阶段。人感染后可呈无症状，也可表现为慢性结肠炎样腹部症状或急性痢疾样症状，严重时可见于体弱或免疫功能低下个体，并可播散至肠外部位。猪感染后则与腹泻和肠炎有关。由于人感染常发生于人与动物、尤其是人与猪密切接触的环境，明确猪群中 B. coli 的流行状况不仅关系到养猪业健康管理，也关系到人兽共患传播风险防控。
当前该领域面临的主要问题包括两个方面。其一，不同地区猪群中 B. coli 的流行情况差异显著，但中国北方山西省作为重要养猪区域，长期缺乏相关流行病学数据，限制了区域防控策略的制定。其二，传统光学显微镜检查虽然可依据虫体大小和形态特征进行初步识别，但难以同时获得遗传分型信息；而常规 PCR 虽可用于感染率与遗传特征的联合分析，却依赖热循环仪等设备、流程较长，不利于基层和现场应用。因此，有必要在开展区域流行病学调查的同时，建立一种快速、准确、设备依赖度低的分子检测方法。
为解决上述问题，研究人员首先以β-微管蛋白（β-tubulin）基因为靶标，采用巢式 PCR 对山西省猪群 B. coli 感染情况进行检测，并结合测序与系统发育分析评估其遗传多样性。结果显示，在341份猪粪便样本中，有256份为 PCR 阳性，总体感染率为75.1%，提示该寄生虫在山西省猪群中流行程度较高。分地区分析表明，不同县之间感染率存在显著差异：祁县最高，其次为山阴县和稷山县。相比之下，不同年龄组和不同性别间的感染率虽有波动，但统计学上无显著差异。该结果说明地区因素与 B. coli 感染分布关系更为密切，也反映出局部生态环境、养殖模式或管理条件可能与流行强度相关，但文中未进一步展开因果分析。
在遗传特征方面，研究人员基于β-微管蛋白基因共获得28条不同序列，序列一致性范围为89.8%～99.9%，显示出较高遗传多样性。所得序列均被系统发育分析明确归类为 B. coli。进一步分型显示，28种序列中有1条序列归属于基因型I，其余27条序列归属于基因型II，且未发现单一样本同时携带基因型I和II。依据文中讨论，基因型I和II均具有跨宿主传播潜力，其中基因型I对应既往报道中具有人兽共患潜力的类型，因此本研究在猪群中检出基因型I，提示山西省部分猪群存在向人或其他宿主传播的潜在风险。与此同时，氨基酸序列比对结果表明，多数多态位点为同义突变，仅有4个位点出现非同义替换，说明该基因虽存在丰富核苷酸变异，但蛋白质水平总体较为保守。
在检测技术创新方面，研究人员建立了一种基于交叉引物扩增（CPA）和侧向层析免疫分析（LFIA）的快速检测生物传感器。该方法以 B. coli 的18S rRNA 基因为靶标，通过设计3组 CPA 引物并进行筛选，最终确定 BC3 为最佳引物组；同时通过温度优化实验确定61°C为最佳扩增温度。该方法的完整检测流程包括恒温扩增与试纸条可视化判读，总耗时为63?min，无需热循环仪等专门仪器，适合资源受限场景使用。灵敏度评价结果显示，该 CPA-LFIA 生物传感器对重组质粒 DNA 的检出限为100?copies/μL，与 PCR 方法相同。特异性测试表明，该方法不会与 Blastocystis sp.、十二指肠贾第鞭毛虫（Giardia duodenalis）、微孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）、隐孢子虫（Cryptosporidium sp.）、胎毛滴虫（Tritrichomonas foetus）、Tetratrichomonas buttreyi 及 Entamoeba sp. 发生交叉反应，具备良好的鉴别能力。进一步在36份猪粪便样本中进行应用验证时，该生物传感器对31份阳性和5份阴性样本的判定结果与 PCR 完全一致，符合率为100%，显示出较强的实际应用潜力。
本研究使用的主要关键技术方法如下：研究对象为2020年11月采自山西省北部山阴县、中部祁县和南部稷山县猪场的341份新鲜猪粪便样本。研究人员提取粪便总基因组 DNA 后，采用以β-微管蛋白基因为靶标的巢式 PCR 进行 B. coli 检测，并对阳性扩增产物实施双向测序；随后利用 BLAST、序列比对和邻接法（neighbor-joining, NJ）系统发育分析评估遗传多样性。快速检测方法部分则构建18S rRNA 基因重组质粒，设计并筛选 CPA 引物组，优化反应温度，并通过 LFIA 试纸条进行可视化判读；同时开展灵敏度、特异性及临床样本一致性验证。
以下结合论文结果部分各小标题，对研究发现进行归纳解读。
3.1. Prevalence of B. coli in Pigs Revealed by the Traditional PCR Targeting the β-Tubulin Gene
通过β-微管蛋白基因靶向的传统 PCR 检测，研究人员确认山西省猪群 B. coli 总体感染率为75.1%。统计分析表明，不同地区间感染率差异显著，祁县和山阴县显著高于稷山县；年龄与性别相关差异未达到统计学显著性。该结果说明 B. coli 在当地猪群中广泛流行，且呈现明显地理异质性。
3.2. Sequence Alignment
通过对β-微管蛋白基因扩增产物进行测序，研究人员获得28种不同序列变体，并发现各地区、不同年龄组及不同性别猪群中均存在不同程度的序列多样性。与参考序列比较显示，这些序列与已报道猪源 B. coli 序列高度相似。氨基酸层面的比对进一步显示，多数变异属于同义突变，仅少数位点出现非同义替换，提示该基因在维持蛋白功能上的保守性较高。
3.3. Phylogenetic Relationships
通过基于β-微管蛋白基因序列的系统发育分析，研究人员确认全部新获得序列均属于 B. coli，并显示其具有相当程度的遗传分化。其中1条序列归为基因型I，提示存在人兽共患传播潜能；其余27条序列归为基因型II。该结果不仅扩展了 B. coli 的遗传变异谱，也提示山西省猪群中流行的 B. coli 以基因型II为主，但已出现具有公共卫生意义的基因型I。
3.4. Primer Screening for the CPA-LFIA Biosensor
为建立快速检测体系，研究人员设计了3组 CPA 引物。通过琼脂糖凝胶电泳和 LFIA 双重评估发现，BC3 引物组在扩增效果和可视化检出方面表现最佳，因此被选为后续方法建立的核心引物组。该步骤为构建稳定可靠的生物传感器奠定了基础。
3.5. Screening of Optimal Reaction Temperature for the CPA-LFIA Biosensor
在55～63°C范围内进行恒温扩增条件筛选后，研究人员确定61°C为最佳反应温度。该温度下 LFIA 试纸条显示最强扩增信号，说明反应体系在此条件下具有最佳扩增效率，为后续标准化检测提供了依据。
3.6. Evaluation of the Sensitivity and Specificity of the CPA-LFIA Biosensor
灵敏度实验显示，CPA-LFIA 生物传感器与 PCR 一样，均可检测到100?copies/μL 的重组质粒 DNA。特异性实验则表明，该方法仅对 B. coli 产生阳性信号，而对多种猪肠道常见原虫相关 DNA 模板均为阴性。由此证明该生物传感器兼具较高灵敏度和良好特异性。
3.7. Evaluation of the Biosensor in Practical Applications
通过对36份已知 PCR 结果的猪粪便样本进行验证，研究人员发现 CPA-LFIA 生物传感器与传统 PCR 的检测结果完全一致，能够准确识别全部阳性与阴性样本。该结果表明，该方法具有良好的诊断一致性和现实应用价值，尤其适合现场筛查与基层实验条件有限的场景。
讨论部分指出，本研究证实了山西省猪群中 B. coli 的高流行水平，并强调了采用分子方法进行流行病学调查的优势。与显微镜检查相比，PCR 不仅能提高检测敏感性，还能用于遗传分型和系统发育分析。研究中发现的基因型I和II提示猪群可能作为跨宿主传播的重要储存宿主，其中基因型I的检出尤其提示人兽共患风险。另一方面，研究人员构建的 CPA-LFIA 方法较传统 PCR 具有明显速度优势，不依赖昂贵热循环设备，适合资源受限地区与养殖现场应用。与此同时，论文也明确指出，CPA 方法虽适合快速筛查，但不能提供序列信息，因此无法替代传统 PCR 在遗传多样性分析和分型中的作用。换言之，两类方法在应用场景上具有互补性：传统 PCR 更适用于流行病学和分子分型研究，CPA-LFIA 更适用于快速检测和现场监测。
研究结论部分可译述如下：采用以β-微管蛋白基因区域为靶标的传统 PCR 方法，本研究揭示山西省猪群中 B. coli 的感染率为75.1%，且不同地区间感染率存在显著差异。结合β-微管蛋白基因的 PCR 扩增与序列分析，研究人员鉴定出具有人兽共患潜力的基因型，提示猪与人之间存在传播可能，尽管该基因型仅在1份样本中检出。此外，研究人员开发了一种用于快速检测 B. coli 的新型 CPA 辅助生物传感器，该方法相较传统 PCR 具有多项优势。传统 PCR 方法与新型 CPA 辅助生物传感器的联合应用，有望提升人和猪 B. coli 感染的检测与防控水平。
