综述：质子泵视紫红质用于生物活动的光遗传学操控及其拓展

《Journal of Biological Chemistry》：Proton pump rhodopsins for optogenetic manipulation of biological activities and beyond

　　

水（H₂O）是包括人类在内的生物体的主要成分，在水溶液中解离为H⁺和OH^-，由此产生的H⁺浓度决定了细胞内的pH以及跨细胞膜的质子动力势（PMF）。这些物理化学参数是广泛生物过程的基本调节因子。光遗传学（optogenetics）利用光来操控生物和细胞功能，通常通过在靶细胞或器官中异位表达作为光感受蛋白的微生物视紫红质（microbial rhodopsins）来实现。本综述全面概述了在多种生物系统中使用H⁺泵视紫红质（H⁺ pump rhodopsins）的光遗传学研究，并强调了它们与神经科学、细胞生物学、生物工程和治疗研究日益增长的相关性。值得注意的是，H⁺浓度的光学控制使得能够精确调节动物和细菌中的神经和非神经活动，突出了H⁺泵视紫红质在光遗传学中的广泛适用性和巨大潜力。基于先前和当前的研究，研究人员讨论了H⁺泵视紫红质分子工具包的进一步扩展如何能够实现细胞内pH动态和PMF的日益精细操控，以探究细胞生理学和设计下一代治疗策略，并考虑了超越经典光遗传学、向生物能量和化学过程的光学控制发展的新兴方向。

**1. Introduction**
生物体主要由水（H₂O）构成，其解离产生的H⁺浓度决定了细胞内pH以及跨细胞膜的质子动力势（PMF）。pH是生物反应的关键调节因子，生物体通过精密机制维持内外pH稳态，例如人类血液pH严格维持在约7.35–7.45，而不同细胞器具有特征性pH值（如溶酶体pH<5.0，线粒体基质pH 7.8–8.0）。PMF定义为[PMF= (2.3RT/F)×ΔpH+Δψ]，不仅贡献于膜电位形成，还是多种PMF驱动转运体及细菌鞭毛马达旋转的能量来源。光遗传学利用光控制生物和细胞反应，主要通过异位表达含有视黄醛（retinal）发色团的视紫红质（rhodopsins）作为光感受蛋白。微生物视紫红质（microbial rhodopsins）分为离子转运体（泵和通道）及激酶/酶调节因子，其光循环（photocycle）机制驱动分子功能。第一个被鉴定的微生物视紫红质是细菌视紫红质（HsBR），一种向外H⁺泵。随后通过宏基因组分析发现了多种多样的微生物视紫红质，包括向内Cl^-泵、向外Na⁺泵、向内H⁺泵及阳/阴离子通道。本综述聚焦于H⁺泵视紫红质，因其在生命各域中广泛存在，且向外和向内H⁺泵的可用性实现了细胞pH和PMF的双向光学控制。

**2. Classical optogenetics of neural activities using microbial rhodopsins**
2005年，阳离子通道视紫红质（CCR）在动物神经元中异位表达，通过向内阳离子（主要为Na⁺）转运引起神经元去极化，实现神经激活。相反，向内Cl^-泵和向外H⁺泵视紫红质分别通过向内Cl^-和向外H⁺转运引起超极化，导致神经抑制。其中，来自古菌的细菌视紫红质-3（AR3或Arch）和Arch-T在哺乳动物和神经元细胞中表现出高蛋白表达水平、良好的膜定位及强光电流，被广泛用于神经抑制。然而，H⁺泵可诱导次级离子流，限制其抑制效率。2015年，天然阴离子通道视紫红质（ACRs）被发现能诱导强超极化和神经抑制。此后，多种CCRs（包括钾选择性通道视紫红质KCRs）和ACRs被鉴定或工程改造，广泛应用于神经元膜电位的光学操控，成为神经科学中的主要光遗传学工具。

**3. Optical control of bacterial activities using H⁺ pump rhodopsins**
在嗜盐古菌中，H⁺泵视紫红质在细胞膜表达并产生PMF，驱动H⁺-ATPase合成ATP。1974年，Racker和Stoeckenius证明光激活的HsBR产生的PMF可驱动重组囊泡中的ATP合成，提示H⁺泵视紫红质可用于光学控制细菌PMF依赖活动（如ATP合成、细胞生长、鞭毛马达功能）。但HsBR在细菌中异源表达时不能形成光活性全蛋白，这一局限因2000年代发现多种微生物视紫红质而被克服，如来自γ-变形菌的原视紫红质（PR）可将光能转化为PMF并驱动ATP合成。此后，多种向外H⁺泵（如PR、Gloeobacter视紫红质GR、delta视紫红质dR）被用于在大肠杆菌中驱动光依赖ATP合成、光合生长及代谢工程（如通过Calvin–Benson–Bassham循环固定CO₂，生产谷胱甘肽等有价值化合物）。向内H⁺泵（如异源视紫红质XeR）也被发现，如来自细菌Parvularcula oceani的PoXeR和来自Rubricoccus marinus的RmXeR。通过共表达dR与PMF驱动的小型多药耐药转运体EmrE，可实现光驱动有毒化合物外排。此外，PR在细菌中异源表达可驱动鞭毛马达旋转，使细胞在光照下游泳。后续研究通过引入向外和向内H⁺泵（AR3和RmXeR）实现PMF的双向光学控制（–140至+146 mV），并调节鞭毛马达旋转速率，证明光驱动的PMF可调控多种细菌活动，并构建与碳代谢相连的人工光合系统，可能用于生物燃料生产。

**4. Optical control of animal cell activities using H⁺ pump rhodopsins**
研究人员利用向外和向内H⁺泵视紫红质操控动物细胞中除神经元膜电位外的其他细胞和生理反应。向外H⁺泵（如AR3和Arch-T）被靶向突触囊泡和溶酶体，实现囊泡酸化的光遗传学控制，从而增加神经递质积累并改变溶酶体水解酶活性。工程化的向内H⁺泵（鱼腥藻感觉视紫红质ASR的D217E突变体）被应用于早晚期内体，实现光依赖的酸化或碱化，抑制AMPA受体内吞并损害浦肯野细胞运动学习。在细胞器操控方面，多个H⁺泵被靶向线粒体内膜，通过光产生PMF，抑制呼吸抑制诱导的细胞死亡、增强ATP合成、延长线虫寿命并减少年龄相关生理衰退。这些研究证明H⁺泵可精确操控细胞器内的pH和PMF，从而控制细胞器特异性功能。此外，在细胞质pH操控方面，Arch-T在视网膜色素上皮细胞中表达导致光诱导的细胞内碱化，激活局部质膜褶皱。为建立通过调控细胞内pH控制细胞活动的光学方法，研究人员选择了细胞死亡作为目标：在碱性条件下，表达AR3（向外H⁺泵）的HeLa细胞死亡速率增加，而表达RmXeR（向内H⁺泵）的细胞死亡速率降低，反映了它们增强或抑制细胞内碱化的相反能力。在生理中性细胞外pH下，AR3诱导的细胞内碱化可触发线粒体介导的凋亡性细胞死亡，并在多种癌细胞系（如MC38、B16F10）中观察到，且在活体小鼠中具有潜在抗癌应用。此外，研究人员开发了光破坏性、基于视紫红质的脂质体，将向内H⁺泵RmXeR重构到pH敏感脂质中，光照触发包封分子（如荧光染料钙黄绿素、编码增强绿色荧光蛋白的mRNA）释放到HeLa细胞中，mRNA进一步翻译，提供了一种光控细胞内递送生物分子的新方法。

**5. Optical imaging of membrane potentials using H⁺ pump rhodopsins and their variants**
H⁺泵视紫红质及其变体被开发为遗传编码的电压指示剂（GEVIs）。Cohen小组首先证明PR在大肠杆菌中表现出电压依赖的近红外荧光变化，随后将AR3应用于动物神经元，成功以高时空分辨率成像神经元活动。此后，通过随机突变产生了多种AR3变体（如QuasAr2、Archon1），以提高荧光产率、信噪比、膜定位和响应动力学。这些GEVIs通常在高强度激光照射下使用，但强光会导致细胞损伤。通过低强度LED照明，可在多种哺乳动物细胞系中成功检测AR3和Archon1的电压敏感荧光，实现药物诱导的慢速膜电位变化的长时程成像。光谱分析表明，AR3的近红外荧光源于Q中间体，而QuasAr2和Archon1的荧光直接来自激发态。其他微生物视紫红质（如ASR、NpHR、GR、HwBR）也表现出强近红外荧光，预示这些视紫红质可作为GEVIs用于神经和非神经细胞膜电位动力学的光遗传学成像。

**6. Future investigations of optogenetics using H⁺ pump rhodopsins and beyond**
**6.1. Enhancement of H⁺ pump activity by secondary chromophores**：H⁺泵视紫红质提供了一种非侵入性、精确操控细胞pH和PMF的方法，且不干扰内源性H⁺运输系统。进一步扩展分子工具包至关重要。黄视紫红质（XR）是第一个被报道的类胡萝卜素结合视紫红质，其类胡萝卜素天线分子作为次级发色团，可扩展光谱敏感性和增强光捕获效率，从而改善H⁺泵活性。因此，开发和工程改造新型类胡萝卜素结合H⁺泵视紫红质有望进一步提高光学pH和PMF控制的通用性。

**6.2. Advanced optogenetic applications of H⁺ pump rhodopsins**：遗传工程的最新进展允许在特定细胞类型和亚细胞区室中精确调控异位基因表达。细胞内pH在组织发育和代谢中通过调节WNT、mTORC1等信号通路发挥关键作用。H⁺泵视紫红质的光遗传学应用有望实现发育过程（如分化、组织生长、形态发生）及代谢功能（如糖酵解、三羧酸循环、肿瘤发生）的光依赖控制。此外，光遗传学工具正被开发为治疗手段，如通过病毒载体递送视紫红质基因恢复视力。研究人员在活体小鼠模型中展示了AR3诱导光依赖性细胞死亡在癌症治疗中的潜力，未来需在临床相关肿瘤条件下进一步验证。

**6.3. Applications of H⁺ pump rhodopsins in chemical reactions**：超越生物活动控制，H⁺泵视紫红质具有驱动化学反应的巨大潜力，包括生物燃料生产、人工光合作用和太阳能转换。向外H⁺泵已报道可诱导细菌和人工脂质体系统中的ATP合成及有价值化合物生产，构建了与碳代谢相连的人工光合系统。此外，多项研究展示了由表达细菌视紫红质（HsBR）的紫膜与导电氧化物电极（如SnO₂、TiO₂、ITO）组成的光伏器件，其中HsBR的光激活诱导局部pH变化并促进电子转移，产生瞬态光电流。通过引入氢醌/苯醌（HQ/BQ）氧化还原电解质，可实现持续而非瞬态的发电。这些发现表明质子泵视紫红质的光捕获特性可用于稳态电化学电荷分离。对于这些表面应用，视紫红质需在苛刻实验条件（如有机溶剂）下保持高稳定性。来自嗜热细菌的视紫红质（如TR、RxR、BeNaR）具有高热稳定性，其中RxR在40%甲醇或乙醇溶液中仍保持可见颜色，显示其对有机溶剂的高抗性，表明热稳定和化学稳定的H⁺泵视紫红质是光伏器件和人工能量转换系统的理想候选。

**6.4. Current limitations and challenges in optogenetic applications using H⁺ pump rhodopsins**：传统上，细胞内pH通过化学方法（如质子载体、内源性H⁺泵抑制剂）操控，但这些方法可能产生人工效应，时间控制有限且通常不可逆。相比之下，H⁺泵视紫红质的光遗传学方法可实现可逆、微创、高时空分辨率的细胞质和亚细胞pH控制。主要局限性在于大多数H⁺泵视紫红质吸收绿光，在深层组织穿透性有限。因此，通过蛋白质工程开发吸收红光或近红外光的H⁺泵视紫红质，以及发现新的天然变体，对扩展体内应用至关重要。

**7. Conclusion**
本综述从生物学和物理化学角度介绍了H⁺泵视紫红质作为光遗传学工具的巨大潜力，其应用已逐步发展用于操控动物和细菌细胞中的多种生理活动，并有望扩展到更广泛的生物学背景，包括植物生理学和下一代治疗策略。基于这些积累的研究，研究人员展望了超越经典光遗传学、向生物能量和化学过程光学控制发展的新兴方向。