过氧甲酸环氧化法测定食用油和脂肪中矿物油芳香烃（MOAH）的优化与评估——一种前景广阔的全方位方法

《Journal of Chromatography A》：Optimisation and evaluation of performic acid epoxidation for the determination of mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH) in edible oils and fats – a promising global approach

　　

研究人员对用于测定食用油和脂肪中矿物油芳香烃（MOAH）的过氧甲酸环氧化法（PFA epoxidation）进行了全面优化与评估。首先，研究人员系统地比较了PFA在不同溶剂（正己烷、氯仿和1-氯丁烷（1-chlorobutane））中的环氧化效果，并与现行标准方法（间氯过氧苯甲酸（mCPBA）乙醇溶液）进行了对比。研究确定了手工操作的优化流程，重点解决了极性溶剂对高效液相色谱（HPLC）分馏的干扰、内标（IST）在溶剂蒸发过程中的损失、环氧化副产物（如环氧脂肪酸）的沉淀以及残留过氧化物对样品稳定性的影响。通过液相色谱-气相色谱-火焰离子化检测器（LC-GC-FID）和全二维气相色谱-质谱联用（GC×GC-MS）分析发现，PFA在正己烷中的环氧化效果与mCPBA相当，而使用极性溶剂（氯仿或1-氯丁烷）能更有效地去除生物源干扰，尤其对于精炼棕榈油等挑战性样品。然而，使用极性溶剂也导致了对MOAH组分（特别是多环芳烃（polyaromatic MOAH, ≥3R））更强的区分（损失）。GC×GC-MS分析表明，环氧化后残留的持久性干扰物极可能至少含有一个芳香环。研究发现，使用较低体积的30%过氧化氢与极性溶剂联用即可达到满意的干扰去除效果，这提高了方法的全球适用性和操作安全性。1-氯丁烷被证实是氯仿的可行且更安全的替代溶剂。总体而言，PFA正己烷法在操作简便性和最小化MOAH损失方面表现最优，而PFA在1-氯丁烷中的环氧化则在干扰去除效果、全球适用性和操作安全性之间取得了良好平衡。该研究为更新DGF和/或ISO标准方法提供了数据支持，并可指导实验室选择最合适的环氧化方案。

### 研究背景与问题

矿物油烃类（MOH）广泛存在于食品、饲料和化妆品中，主要分为矿物油饱和烃（MOSH）和矿物油芳香烃（MOAH）。由于MOAH组分，特别是含有三个及以上稠合芳香环的化合物，可能具有基因毒性致癌性，欧盟已开始逐步实施其法定限量标准，这凸显了对稳健、可重复分析方法的需求。当前，MOSH和MOAH的常规定量分析采用在线液相色谱-气相色谱-火焰离子化检测法（LC-GC-FID）。然而，在食品基质中，生物源脂质成分如烯烃（角鲨烯、甾烯、胡萝卜素等）会与MOAH共洗脱，干扰准确定量。为去除这些干扰，间氯过氧苯甲酸（mCPBA）环氧化法被广泛应用并标准化。但该方法存在一些缺陷，例如对某些精炼油（如棕榈油）中持久性干扰物的去除不彻底，以及试剂（mCPBA）需要预处理以降低空白值。近年来，Nestola（2022）探索了原位生成过氧甲酸（PFA）环氧化法，在自动化流程中显示出更优的干扰去除效果，但该方法需使用氯仿和50%过氧化氢，引发了对其操作安全和全球可及性的担忧，且手动操作方案尚不完善。因此，本研究旨在：1）开发稳健、适用于常规手工操作的PFA环氧化方案，并具有全球适用性；2）系统评估其与现行mCPBA标准法在干扰去除和MOAH区分（损失）方面的性能，以期为未来标准方法的更新提供依据，并促进用户对该技术的理解。

### 主要关键技术方法

研究人员为开展本研究，主要采用了以下关键技术方法：
1. **PFA环氧化法优化：** 基于Nestola（2020, 2022）的工作，在三种溶剂体系（正己烷、氯仿、1-氯丁烷）中优化了手工PFA环氧化流程。关键优化参数包括：试剂（过氧化氢、甲酸/磷酸）体积、过氧化氢浓度（50% vs. 30%）、反应时间、溶剂比例，以及是否进行皂化后直接环氧化。
2. **样品前处理技术：** 采用优化的皂化法（参照Koch et al., 2025）进行油样前处理，并引入了一种小型化硅胶净化柱以去除环氧化副产物（环氧脂肪酸）和残留过氧化物，确保样品稳定性和进样系统安全。
3. **仪器分析技术：**
* **LC-GC-FID：** 用于MOAH和MOSH的常规定量分析，遵循DGF C-VI 22（20）标准方法。
* **GC×GC-MS：** 使用反相柱系统（DB-17ms + PS255），对环氧化后残留的持久性干扰物进行表征和初步鉴定。
* **LC-GC×GC-FID：** 用于量化不同环氧化方法对不同环数MOAH亚组分（单环1R、双环2R、多环≥3R）的区分（损失）程度。
4. **样本来源：** 所用油样包括参考材料PROOF-ACS的椰子油（加标和空白）、项目合作方提供的精炼棕榈油、氢化大豆油、精炼葡萄籽油，以及矿物油产品（TWO 500，SN 500，DAE 500）。

### 研究结果

**3.1. 开发常规适用的人工PFA操作流程**
通过系统优化，研究人员解决了极性溶剂干扰HPLC分馏、内标（IST）在蒸发过程中的损失、环氧脂肪酸沉淀和残留过氧化物稳定性等关键问题。最终确立了三种优化的手工操作流程：
* **PFA在正己烷中：** 皂化后直接环氧化（无需预蒸发），使用400 μL 50% H₂O₂和甲酸/磷酸（9:1），65°C反应20 min。之后经小型硅胶柱净化，再蒸发浓缩至1 mL。
* **PFA在氯仿中：** 皂化后萃取液需先蒸发至≤1 mL，然后加入2 mL氯仿、100 μL 30% H₂O₂和甲酸/磷酸（9:1），65°C反应20 min。反应后需加入正己烷进行相转换以移除水相，再经小型硅胶柱净化、真空离心蒸发至干，最后用正己烷复溶。
* **PFA在1-氯丁烷中：** 皂化后萃取液需先蒸发至≤1 mL，然后加入2 mL 1-氯丁烷、200 μL 30% H₂O₂和甲酸/磷酸（9:1），65°C反应20 min。反应后移除水相，再经小型硅胶柱净化、真空离心蒸发至干，最后用正己烷复溶。

**3.2. 生物源干扰的去除**
研究人员通过LC-GC-FID分析多种油脂样品，比较了四种环氧化方法（mCPBA乙醇法、PFA正己烷法、PFA 1-氯丁烷法、PFA氯仿法）。结果表明：对于多数油脂，PFA正己烷法与mCPBA乙醇法效果相当。对于精炼棕榈油和氢化油等挑战性样品，PFA在极性溶剂（氯仿和1-氯丁烷）中表现出更优的干扰去除效果。PFA氯仿法效果最佳，PFA 1-氯丁烷法与之非常接近。GC×GC-MS分析表明，环氧化后残留的干扰物主要位于双环MOAH的洗脱区域，补充分析的提取离子色谱图（EIC）进一步证实，这些持久性干扰物极可能至少含有一个芳香环。研究人员初步鉴定出四种单环芳香甾烯。

**3.3. MOAH的区分（损失）**
研究人员通过回收率实验和LC-GC×GC-FID分析了不同方法对MOAH组分的损失情况。结果显示：
* 对于精炼程度较低的矿物油（TWO 500），PFA正己烷、mCPBA和PFA 1-氯丁烷法几乎无损失，而PFA氯仿法损失约10%。
* 对于精炼程度较高的矿物油（SN 500，特别是富含多环芳烃的DAE 500），所有方法均出现MOAH损失。损失程度顺序为：PFA正己烷法 < mCPBA乙醇法 < PFA 1-氯丁烷法 < PFA氯仿法。
* 所有方法均表现出对多环（≥3R）MOAH的区分最强（损失最大），对单环MOAH的损失最小，选择性相似。这表明损失程度与MOAH污染物的精炼度和芳香环数量密切相关。

### 总结讨论

本研究对PFA环氧化法进行了全面优化和评估，提供了不同方案下干扰去除效果与目标分析物损失之间的权衡信息。PFA正己烷法操作简便，MOAH损失最小，且能获得与mCPBA标准法相当的干扰去除效果，是目前最有潜力的手工操作方案。PFA 1-氯丁烷法在干扰去除、全球适用性和操作安全性之间取得了良好平衡，是氯仿的优越替代品。PFA氯仿法虽干扰去除最强，但MOAH损失也最大，且需使用氯仿。研究结论强调，PFA环氧化是一种有效的辅助方法，但其应用仍需在最佳干扰去除与最小MOAH损失之间寻求平衡。未来对残留干扰物的进一步确认分析（如LC-LC或GC×GC）将是必要的。目前，更新版本的DGF C-VI 22（20）标准方法已计划纳入PFA环氧化法。