《Journal of Immunological Methods》：Establishment of a versatile histidine-rich glycoprotein (HRG) measurement methodology bearing a highly compatible design for patients with sepsis in daily clinical practice
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Takaoki Uchiumi|Ken-ichi Shimosako|Masahiro Nishibori|Hiroshi Morimatsu|Masahiko Oiwa|Yoko Inoue|Hiroshi Nishi|Norio Ota摘要脓毒症是一种危及生命的疾病，需要可靠
Takaoki Uchiumi|Ken-ichi Shimosako|Masahiro Nishibori|Hiroshi Morimatsu|Masahiko Oiwa|Yoko Inoue|Hiroshi Nishi|Norio Ota
摘要
脓毒症是一种危及生命的疾病，需要可靠的生物标志物来进行准确的临床评估。富含组氨酸的糖蛋白（HRG）被视为与脓毒症严重程度相关的有潜力的生物标志物。此前我们利用单克隆抗体69-1?A和75-2D开发了一种ELISA方法，用于灵敏且特异性地检测血浆中的HRG。不过，该检测方法需要大量稀释样本，并且还需进一步优化以提高分析的稳定性。在本研究中，我们通过降低样本稀释比例，并采用含有少量游离75-2D抗体的竞争反应系统，将可检测的HRG浓度范围扩大到更高水平，从而优化了ELISA检测方法。优化后的检测方法能够覆盖16–250?μg/mL的血浆HRG浓度范围，其变异系数也低于之前的方法。此外，优化后的方法与之前的ELISA结果具有良好的一致性。我们还评估了重组单亚型HRG蛋白作为该检测系统的候选校准物质。由于两种亚型的反应性和稀释线性度相当，基于其更简单的糖基化特征以及通过氨基酸分析可实现的定量能力，我们选择了重组Form-1 HRG（在204位上带有Pro基团，分子量为75?kDa）作为实用的候选校准物质。我们的新发现为优化ELISA检测系统以及使用单亚型重组校准物质以实现更稳定的HRG检测提供了依据。预计后续还将进行分析标准化和临床验证工作，以便将该检测方法应用于实际临床中。
引言
根据《2024年日本脓毒症及脓毒性休克管理临床实践指南》（J-SSCG 2024，Shime等人，2024年），脓毒症是指机体对感染性疾病的生理反应出现紊乱，进而导致严重器官损伤的临床状态。一旦发生脓毒性休克，血液循环和细胞内代谢的异常会使病情进一步恶化，死亡率也会显著升高（Rhee等人，2017年；Fleischmann等人，2016年）。为了诊断和监测疾病进展，人们会使用多种血液生物标志物及生理指标（Wu等人，2017年；Bloos和Reinhart，2014年）。在临床实践中，降钙素原、前脓毒症蛋白、白细胞介素-6和C反应蛋白等生物标志物通常作为市售的体外诊断产品被广泛应用（Liu等人，2016年；Wacker等人，2013年；Mat-Nor等人，2016年；Kobayashi等人，2021年）。
尽管降钙素原、C反应蛋白、前脓毒症蛋白和白细胞介素-6等生物标志物已在临床中使用，但它们在灵敏度、特异性、升高时间或复杂炎症状态下的解读方面都存在一定的局限性。由于脓毒症是一种涉及炎症紊乱、凝血功能异常、内皮功能障碍以及多器官损伤的异质性综合征，目前没有任何一种生物标志物能够满足所有临床场景下的全面评估需求。因此，人们认为其他生物标志物可以补充现有的检测方法，有助于更好地对患者进行分层，并为临床决策提供支持。所以，能够补充现有检测方法的额外生物标志物有望提升患者的分层水平及临床决策的质量。
然而，脓毒症会表现出多种症状，且常伴有多器官严重损伤的迹象，因此需要结合多项临床检测结果来全面评估患者的状况（Liu等人，2015年；Yang等人，2018年；Parlato等人，2018年）。与脓毒症严重程度相关的更多生物标志物信息，有助于实现更准确的临床评估和管理。基于此，我们研究了血液中富含组氨酸的糖蛋白（HRG）的特性，旨在明确其作为脓毒症生物标志物的潜在优势（Kuroda等人，2018年；Nishibori等人，2018年；Kuroda等人，2021年）。这些特性使得HRG成为一种很有潜力的辅助生物标志物，能够反映与脓毒症相关的病理生理过程，如免疫血栓形成、内皮功能障碍以及炎症紊乱。如果能够开发出一种适用于常规临床检测的可靠血浆HRG检测方法，那么就有助于进一步研究其在早期风险评估、疾病分层和治疗监测中的作用。
HRG是一种在人类血浆中含量丰富的蛋白质，其中含有大量的组氨酸残基，约占其氨基酸残基总量的12%（Poon等人，2011年；Blank和Shoenfeld，2008年）。先前的研究已经表明，HRG是一种多功能蛋白质，参与多种生理过程，包括血液凝固调节、血管生成以及免疫反应等。据推测，HRG是通过与血液中的多种分子相互作用来调控这些过程的，这些分子包括纤维蛋白原、肝素以及生长因子等（Blank和Shoenfeld，2008年；Shannon等人，2010年；Nishimura等人，2019年；Wake等人，2016年；Gao等人，2019年）。为了推动针对HRG的临床研究，我们之前尝试开发一种高性能的HRG检测试剂，用于分析人类血液样本。我们的试验成功构建了一种新的酶联免疫吸附测定法（ELISA）原型系统，可用于检测人类血浆样本中的HRG含量（Uchiumi等人，2025年）。ELISA方法属于配体结合检测技术，具有较高的灵敏度，且无论检测过程是手动操作还是自动化操作，都具有较好的稳定性和灵活性。此外，其检测流程也非常简单。正因如此，ELISA方法已成为开发自动化、大规模免疫反应类检测试剂的基础。
由于脓毒症通常是一种严重且可能致命的疾病，因此需要高度重复性的生物标志物检测结果，才能为患者的分层以及准确的临床评估提供支撑。基于此，我们开始努力提升HRG ELISA检测方法的实用性能和重复性。与此同时，我们也尝试寻找更为稳定的HRG定量校准策略。在本报告中，我们介绍了优化后的ELISA检测系统的开发情况，该系统能够覆盖更广、更具临床意义的血浆HRG浓度范围，同时还评估了重组单亚型HRG制剂作为候选校准物质的适用性。
章节节选
人类血浆中HRG蛋白的纯化（源自人类血浆的标准抗原）
我们使用了市售的人类血浆（来自日本东京的日本红十字会），首先通过镍氨三乙酸（Ni-NTA）亲和层析法（Qiagen公司，德国希尔德恩）进行处理，之后再通过高效液相色谱法（HPLC）结合Mono Q柱（GE Healthcare公司，英国查尔方特圣吉尔斯）进行纯化，最终得到了含有两种亚型的纯化HRG溶液：野生型（CAS注册号481,289–16-1）及其突变型（CAS注册号953,489–04-8）。随后，HRG组分还经过了进一步的透析处理
固相抗体浓度的优化
我们将不同浓度（3、5、7、10和15?μg/mL）的mAb 75-2D溶液加入微孔板的每个孔中。使用这些微孔板，我们对标准HRG蛋白进行了五点浓度检测，检测浓度为0.05、0.025、0.0125、0.0063和0.0031?μg/mL，由此得出的结果如图1a和b所示。在3、5和7?μg/mL的溶液浓度下，当标准HRG浓度为0.05?μg/mL时，其吸光度值大于2.5，这说明该浓度条件是合适的
为推动HRG ELISA系统更广泛应用需解决的分析问题
本研究的一个重要目标是提升我们之前开发的HRG ELISA方法的分析性能和实际应用价值。与立即将其用于常规临床检测或收集数据以用于体外诊断应用相比，本研究的目的是提供一种更具重复性的检测格式以及更为稳定的校准策略，为未来的分析和临床验证工作奠定基础。
此外，我们还需要解决
结论
综上所述，我们开发了一种优化后的ELISA检测方法，用于检测血浆中的HRG。该方法降低了样本稀释的要求，同时将实际检测范围扩展到了16–250?μg/mL。与之前的ELISA方法相比，该方法的重复性也得到了提升。此外，我们还证明重组单亚型HRG，尤其是Form-1，是该检测系统的理想候选校准物质。这些研究成果为实现更稳定的HRG检测提供了方法学基础
CRediT作者贡献说明
Takaoki Uchiumi：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，监督，软件，资源，项目管理，方法学，研究，资金获取，正式分析，数据整理，概念构思。Ken-ichi Shimosako：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，监督，软件，资源，项目管理，方法学，研究，正式分析，数据整理，概念构思。
利益冲突声明
本研究是由日本医学研究开发机构（AMED）资助的项目的一部分，项目编号为JP 22lk0201085，研究在冈山大学开展。
致谢
作者们要感谢冈山大学的Kunihisa Kamikawa先生、Mariko Yata女士，以及Shionogi & Co., Ltd.公司的Miho Kakutani女士，感谢他们为这项合作研究项目所付出的努力。
