高分辨率微特斯拉原位13C NMR技术用于检测[1-13C]丙酮酸的“放大版”SABRE超极化现象

《Journal of Magnetic Resonance》：High-resolution microtesla in-situ13C NMR detection of “scaled-up” SABRE-hyperpolarization of [1-13C]pyruvate

　　

阿布巴卡尔·阿卜杜拉希姆|约瑟夫·N·吉耶西|希拉兹·南托格马|帕特里克·汤姆洪|安娜·萨莫伊连科|克莱门蒂娜·奥拉敦|博伊德·M·古德森|马修·S·罗森|托马斯·泰斯|查理·费尔|爱德华·Y·切克梅涅夫

美国密歇根州底特律市韦恩州立大学芭芭拉·安·卡曼诺斯癌症研究所分子治疗项目化学系，分子治疗计划，邮编48202

摘要

SABRE-SHEATH（通过可逆交换在屏蔽层中放大信号以实现向异核原子转移对齐）是一种基于副氢的超极化技术，越来越多地被用于代谢检测。该技术通常受限于5毫米的NMR管反应器（体积为0.5–1毫升），且需要手动转移样品才能进行定量分析，因此其处理能力较为有限。在此，我们介绍了一种新的低场磁共振系统，可用于对超极化的[1-¹³C]丙酮酸进行原位偏振测量。该系统采用磁金属屏蔽的螺线管磁体，在0.4微特斯拉下进行超极化处理（SABRE-SHEATH），并在140微特斯拉、1.6千赫的¹³C频率下进行原位NMR检测，从而无需转移样品。我们证明，表面线圈检测设计能够适配多种样品几何结构，包括直径为15毫米的HPLC柱。通过将副氢流速提高12倍，我们成功将[1-¹³C]丙酮酸的生成规模扩大到10毫升体积，其极化程度达到了7%，与0.8毫升的小样本水平相当。此外，自动流体控制系统以及马鞍形射频激励线圈的结合，使得SABRE-SHEATH和Spin-Lock Induced Crossing（SLIC）-SABRE两种技术得以应用。值得注意的是，我们展示了这种原位检测技术在优化SABRE实验条件方面的作用，包括筛选DMSO浓度。最后，该技术能够使用多种溶剂体系并实现可扩展的体积控制，这为制备生物相容性的超极化分子探针奠定了基础，进一步拓展了代谢研究的潜力。这些进展为大规模、自动化地制备更大体积的生物相容性超极化分子探针提供了可能。

引言

NMR超极化技术能够将核自旋极化程度提升至传统高场磁体所达到的平衡水平的五个数量级以上[1]、[2]。由于NMR信号与核自旋极化强度P成正比[3]，这一灵敏度提升使得该技术得以应用于多种领域，包括在体内对代谢途径进行光谱追踪和成像[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。[1-¹³C]丙酮酸是目前最常用的超极化分子探针，因为它在细胞能量代谢途径中处于核心位置——尤其是丙酮酸向乳酸的转化率升高，这是癌症及其他代谢疾病的典型特征[9]、[10]、[11]、[12]。事实上，根据clinicaltrials.gov的统计，目前有超过20项临床试验正在使用[1-¹³C]丙酮酸。

目前已有多种技术被用于制备超极化的[1-¹³C]丙酮酸，包括溶解动态核极化技术d-DNP[13]、副氢诱导极化-侧臂氢化技术PHIP-SAH[14]、[15]，以及信号放大通过可逆交换技术SABRE[16]、[17]。尽管每种方法都有其优势，也为基于丙酮酸的应用发展做出了重要贡献，但最新出现的SABRE技术因其简单性以及较低的仪器和化学试剂成本而更具优势[17]。

SABRE技术[17]依赖于副氢(p-H₂)与[1-¹³C]丙酮酸在极化转移复合物（PTC，通常为Ir(IMes)(COD)Cl预催化剂[18]，其中IMes=1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)咪唑-2-亚基；COD=环辛二烯[19]，本研究中也使用了该催化剂）上的同时化学交换，如图1所示。PTC的形成利用了由

-H₂衍生的氢化物与底物中的1-¹³C原子之间短暂形成的自旋-自旋耦合，从而高效地将自旋序转变为可检测的¹³C磁化强度[20]。这种¹³C SABRE超极化过程在静态亚微特斯拉磁场下最为有效，此时采用SABRE-SHEATH技术；或者在共振交变磁场下则采用SLIC-SABRE技术——也被称为LIGHT-SABRE技术（低辐射产生高特斯拉SABRE技术[26]）。这两种方法均能实现[1-¹³C]丙酮酸的高程度¹³C极化，极化程度可超过10%[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。由于技术简单且成本低，使用远低于地球磁场的超低磁场也能产生相对均匀的磁场，从而促使[1-¹³C]丙酮酸进入超极化状态，因此这两种方法都极具优势。然而，在如此低的磁场下，尤其是在5毫米NMR管中检测小体积样品时，对¹³C极化进行NMR检测难度较大，而这正是通常进行SABRE极化处理的场景[30]、[32]、[33]、[34]。因此，虽然目前还无法实现SABRE ¹³C超极化的原位NMR检测，但这一功能极为重要，因为对SABRE技术中¹³C超极化状态的实时监测对于优化实验流程至关重要：首先，原位检测可以直接显示¹³C极化的程度，无需转移样品；其次，原位检测还可用于测定样品的活化及松弛动力学，这一方法此前已在自旋交换光学泵浦技术中得到应用[35]、[36]、[37]、[38]。目前已有多种技术在微特斯拉磁场下用于检测¹³C核自旋磁化强度，其中最常用的是在120微特斯拉下使用SQUID设备[39]。在本研究中，我们报告了在0.4微特斯拉下通过SABRE-SHEATH技术制备的超极化[1-¹³C]丙酮酸，然后在140微特斯拉下进行原位检测的结果。为实现这一目标，我们首先在超极化装置中于0.4微特斯拉下进行SABRE-SHEATH处理，之后再将磁场提升至140微特斯拉进行检测。

SABRE及其SABRE-SHEATH版本所使用的仪器还有一个关键限制，那就是通常需要使用5毫米的NMR管作为同时进行化学交换的反应容器。尽管该领域已经取得了诸多成就，但NMR管的最大限制在于其所能容纳的样品体积——通常仅为1毫升左右[27]、[28]、[31]、[33]、[41]、[42]、[43]、[44]、[45]、[46]、[47]、[48]。在本研究中，我们展示了将HPLC柱作为反应容器，用于SLIC-SABRE和SABRE-SHEATH技术对[1-¹³C]丙酮酸进行超极化处理。我们发现，10毫升规模的溶液也能达到与5毫米NMR管中0.8毫升溶液相似的7%左右的¹³C极化程度，且极化建立时间也相近。这一效果的实现得益于按比例增加

-H₂气体的流速。此外，我们还展示了通过自动化流程实现这一目标的成果，该流程使用了配备TTL接口的Kea2 NMR光谱仪，可通过该光谱仪控制螺线管阀门。我们预计，这些研究成果将为开发适用于多种应用的规模化SABRE平台铺平道路，尤其是那些涉及制备生物相容性的超极化丙酮酸[31]、[32]、[33]、[41]、[43]、[45]、酮亮氨酸[42]、[49]、[50]以及酮戊二酸[44]、[51]的解决方案。

章节节选

放大型的低场极化器

如图2所示，这款放大的低场极化器旨在用于对更大体积的[1-¹³C]丙酮酸溶液进行超极化处理，其处理规模远远超过通常在5毫米NMR管中能够实现的规模（0.6–1毫升）。该极化器配备了1.6千赫频率的调谐射频线圈，用于检测NMR信号；还有一个未经调谐的马鞍形体积线圈（B₁线圈，用于发射射频脉冲）；此外还配备了Kea2 NMR光谱仪（来自新西兰的Magritek公司）。选用如此大型（约5升）的极化器的原因在于

超低场¹³C NMR光谱学与系统校准

磁金属屏蔽层能够使地球磁场衰减约1500倍，因此，我们系统中螺线管产生的均匀磁场使得在1.6千赫频率下进行高分辨率的¹³C NMR光谱分析成为可能。实际上，图4b和d展示的谱图分辨率极高，全宽半高小于0.5赫兹，甚至能够清晰分辨出1.1赫兹的³J_CH跃迁。如此高的光谱分辨率表明，该系统在生成高精度B₀磁场方面的设计十分成功，这一点尤其重要

结论

在本研究中，我们成功开发并验证了一种低场NMR仪器平台，该平台能够在放大的SABRE超极化装置中实现高分辨率的原位微特斯拉级¹³C偏振测量，同时支持SABRE-SHEATH和SLIC-SABRE两种工作模式。由于该系统在1.6千赫的¹³C共振频率下以音频频率范围运作，且在140微特斯拉的检测磁场下工作，因此完全避免了与极化损失相关的各种问题，同时也简化了系统设计

CRediT作者贡献说明

阿布巴卡尔·阿卜杜拉希姆：负责撰写原始草稿、方法设计、实验研究、正式分析以及数据整理工作。约瑟夫·N·吉耶西：负责方法设计、实验研究以及数据整理工作。希拉兹·南托格马：负责方法设计以及数据整理工作。帕特里克·汤姆洪：负责数据整理以及概念构思工作。安娜·萨莫伊连科：负责监督工作、方法设计、正式分析以及数据整理工作。克莱门蒂娜·奥拉敦：负责实验研究、正式分析以及数据整理工作。博伊德·M·古德森：负责撰写审稿与编辑工作，以及资金筹集工作。马修·S·罗森：负责撰写工作——

利益冲突声明

作者们声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：BMG和EYC在XeUS Technologies, LTD公司持有股份；BMG、MSR和EYC在Perxeus Technologies, Inc.公司持有股份；MSR是Hyperfine Inc.的创始人兼股东，同时还是Deepspin GmbH的顾问兼股东。

致谢

作者们感谢美国国立卫生研究院提供的资助，相关项目编号为R01EB034197（由MSR和EYC共同申请）、R21EB033872（由EYC和BMG共同申请），还有NSF CHE-2404387和NSF CHE-2404388项目。此外，本研究还部分得益于美国能源部下属的生物与环境研究办公室提供的支持，相关项目编号为DE-SC0023334和DE-SC0025315。MSR还感谢Kiyomi和Ed Baird MGH研究学者奖的慷慨支持。AA、CO、JG和EYC也对此表示感谢