热滴定分子动力学方法揭示了主要蜂王浆蛋白1的温度依赖性结构稳定性

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：Thermal Titration Molecular Dynamics (TTMD) Reveals the Temperature-Dependent Structural Stability of Major Royal Jelly Protein 1

　　

耶林·阿达利娜|古斯妮娅·梅琳·戈拉姆|迪马斯·安德里安托|I.马德·阿尔蒂卡|西蒂·苏米亚蒂·索利哈特|雷尼·萨维特里|纳斯万迪·努尔|古纳万·特里·桑迪·帕萨里布|拉登·埃萨·潘格萨·古斯蒂|埃卡·诺夫里扬蒂|梅琳娜·普吉亚尼

印度尼西亚博戈尔市西比农，国家研究创新局应用植物学研究中心，邮编16911

摘要

蜂王浆主要蛋白1（MRJP1）被视为蜂王浆的核心成分；因此，研究其在不同环境温度条件下的最佳结构行为，有助于为蜂王浆的储存提供有效策略。本研究采用热滴定分子动力学方法，通过100纳秒的模拟轨迹进行分析，进而结合均方根位移、均方根力、回转半径、二级结构分析、主成分分析、正常模式分析、自由能景观、残基相互作用网络以及残基通信模式分析等手段，对277开尔文、300开尔文、310开尔文、320开尔文、329开尔文、338开尔文和369开尔文等多组温度条件下的蜂王浆主要蛋白1结构进行了全面评估。研究表明，MRJP1会随着温度变化而发生一系列构象转变、残基通信模式改变以及稳定性变化。总体而言，277–310开尔文的温度范围可能最适合保持MRJP1的稳定性。不过，仍需通过实验室实验来验证这些计算结果。

引言

蜂王浆是由蜜蜂Apis mellifera的咽下腺和下颌腺分泌产生的物质，是蜂后幼虫及成年蜂后的唯一食物来源[1]、[2]。蜂王浆含有多种营养成分，包括蛋白质、必需氨基酸、脂类、碳水化合物、维生素和矿物质，长期以来被认为是一种在传统医学和现代生物医学领域都具有多种健康益处的天然产物[3]。大量研究表明，蜂王浆具有抗氧化、抗炎和抗菌作用，还能调节免疫反应和代谢过程[4]。从成分上看，蜂王浆通常含有约12–18%的粗蛋白、7–18%的总糖分，以及脂类、矿物质和游离氨基酸。其中，约80–90%的可溶性蛋白属于蜂王浆主要蛋白家族，目前该家族已确定有九种成员（MRJP1–MRJP9）。在这些成员中，MRJP1、MRJP2和MRJP3含量最多，且与蜂王浆的生物活性关系最为密切。

MRJP1的分子量约为55–57千道尔顿，它能够形成多种寡聚体结构，其分子量根据pH值、校准方法以及蜂王浆中的阿皮西明和24-甲烯胆固醇等甾醇的组成不同，可介于228千道尔顿、254–280千道尔顿、338–350千道尔顿、408千道尔顿到639千道尔顿之间。此前已有研究试图解析MRJP1的单体和寡聚体结构，但仍然存在诸多科学难题，尤其是传统分离技术的效率较低。正如Nozaki等人[5]所指出的，传统的纯化方法，如为期七天的透析和反复离心，由于蜂王浆难以溶解且容易降解，因此只能获得极少量的MRJP1。至今，尚未形成一种能够稳定获取MRJP1的完整纯化策略。此外，目前的结构研究主要集中在寡聚体状态上，而MRJP1的完整三级结构仍未被确定[6]、[7]。

蜂王浆的生产质量和产量受多种因素影响，包括蜜蜂的基因特性、环境条件、蜂群管理方式以及蜂巢内的温度[8]。在这些因素中，储存温度对于保证蜂王浆采收后的质量起着至关重要的作用[9]。如果在生产或储存过程中温度控制不当，可能会导致MRJP蛋白以及10-羟基-2-癸烯酸（10-HAD）等生物活性物质的降解，而这些物质正是衡量蜂王浆质量的关键指标[10]。Moriyama等人[11]的研究表明，在特定的储存温度下，蜂王浆中的蛋白质成分会发生显著变化。尤其是55–57千道尔顿的单体MRJP1蛋白在某些温度条件下会逐渐降解，这说明蜂王浆的整体质量在很大程度上取决于温度控制。

蜂王浆主要蛋白是蜂王浆中占比最高的蛋白成分，约占总蛋白含量的82–90%。在这一家族中，由于含量丰富且具有重要的生物学意义，MRJP1尤其受到关注。实际上，MRJP1约占蜂王浆中水溶性蛋白总量的48%，并被认为对蜜蜂的生长发育和分化起着关键作用[6]。此外，MRJP1的C端区域还含有名为杰莱因的抗菌肽[12]。最近的研究[8]进一步指出，优化采收后的储存条件，尤其是温度控制，对于保持蜂王浆的质量至关重要。

总体而言，针对不同温度条件下如何提高MRJP1结构稳定性的研究还相对有限。因此，有必要开展更多研究，以制定出高效的方法，从而在蜂王浆的采收后处理和储存过程中保持其质量。尤其是温度控制是影响MRJP1稳定性的关键因素。基于此，本研究旨在通过计算方法探讨有利于维持MRJP1结构稳定的最佳温度条件。通过系统性的温度模拟，本研究希望为了解温度对MRJP1结构和稳定性的影响提供科学依据，进而为改进MRJP1的纯化工艺以及蜂王浆的采收后储存策略提供有价值的参考。

内容片段

计算方法与建模

本研究采用了存储在RCSB蛋白质数据库中的蛋白质结构，其PDB编号为5YYL[6]，通过计算预测方法来研究温度对蛋白质结构的影响。该蛋白质结构首先被下载下来，随后使用YASARA Structure软件进行预处理。之所以需要预处理，是因为后续分析并不需要某些结构组件。与蛋白质相关的水分子被去除，仅保留5YYL结构中的A链用于后续分析

结果与讨论

本研究采用了改良的热滴定分子动力学方法。在我们的实验室中，这种方法是近年来用于研究来自Apis mellifera蜂王浆的蜂王浆主要蛋白1（MRJP1）结构行为的新型技术框架。据我们所知，此前尚未有研究将这种方法应用于MRJP蛋白家族（MRJP1–MRJP9）的相关研究。我们将这种改良方法称为适配版方法

结论

综上所述，可以确定的是，MRJP1的功能和行为会受到温度条件的显著影响。通过基于热滴定分子动力学的计算预测，发现温度会影响MRJP1的结构稳定性、紧凑性、完整性、灵活性、波动性、分子运动、结构偏差、能量构象、分子间相互作用以及残基间的通信模式。预测结果表明

CRediT作者贡献说明

I.马德·阿尔蒂卡：写作——审阅与编辑、软件使用、资源获取、正式分析、数据整理、概念构建。迪马斯·安德里安托：写作——审阅与编辑、结果验证、软件使用、资源获取、正式分析、数据整理、概念构建。西蒂·苏米亚蒂·索利哈特：写作——审阅与编辑、资源获取、正式分析、数据整理。梅琳娜·普吉亚尼：写作——审阅与编辑、资源获取、正式分析、数据整理。埃卡·诺夫里扬蒂：写作——审阅与编辑、资源获取、正式分析，

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

数据可用性声明

如需获取支持本研究结果的数据，可向通讯作者提出合理请求。

资金支持

本研究得到了“为印度尼西亚发展而进行的研发”计划（RIIM）中“2025年生物分子结构与生物多样性生物学”项目的资助（项目编号：RIIM-ORHL BS2-2032266926376）。

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢印度尼西亚国家研究创新局BRIN通过“为印度尼西亚发展而进行的研发”计划中的“生物分子结构与生物多样性生物学”项目所提供的支持。