综述：脊髓损伤中的间充质干细胞来源的小型细胞外囊泡：从分子修复机制到标准化转化应用发展

《Journal of Neuroscience Methods》：Mesenchymal Stem Cell-Derived Small Extracellular Vesicles in Spinal Cord Injury: From Molecular Repair Mechanisms to Standardized Translational Development

　　阿尔瓦·奥马尔·阿尔卡提布|乌卢格贝克·阿赫梅多夫|贾洛利丁·曼苏罗夫|拉布·马齐·贾巴尔|K.V.贾穆纳|拉克斯米达尔·马哈拉纳|尼拉吉·贝因萨尔|迪维亚·辛格哈尔•MSC-EVs能针对脊髓损伤中的多种继发性损伤途径发挥作用。•免疫调节是最有力的机制证据。•EV产品的身份鉴定与效力检测仍是关键障碍。•生物工程化的递送方式可能有助于提高其在损伤部位的留存效率。•在将其应用于临床之前，需要进行对照试验。

引言
间充质干细胞（MSCs）是一种多能的基质细胞，可从多种成体及围产期组织中分离出来。这类细胞的典型特征包括具有可塑性黏附性、表达CD105、CD73和CD90蛋白、不含造血相关标志物，以及具备多向分化能力（Dominici等人，2006年）。虽然最初人们认为它们可作为替代细胞使用，但后续研究显示，它们的主要治疗价值更多体现在向受损组织释放的各种信号上（Pittenger等人，2019年；Galipeau和Sensébé，2018年）。这些信号包括生长因子、细胞因子、脂质以及调控性RNA，它们能够影响炎症反应、细胞存活、血管生成以及组织重塑过程（Pittenger等人，2019年；Galipeau和Sensébé，2018年；Kalluri和LeBleu，2020年）。从这个意义上说，MSCs更像是受伤微环境中的生物协调者，而非简单的构建模块（Galipeau和Sensébé，2018年；Kalluri和LeBleu，2020年）。

这种观念的转变使得人们的注意力从细胞本身转向了它们所分泌的微小信号分子。细胞外囊泡（EVs）是一种由脂质双层构成的颗粒，能够在细胞间传递生物活性物质，从而解释了许多原本归因于整个MSC细胞的旁分泌效应（Galipeau和Sensébé，2018年；Kalluri和LeBleu，2020年；Welsh等人，2024年）。在脊髓损伤相关研究中，许多源自MSC的小型EV制剂过去被称作外泌体；不过根据2023年发布的《细胞外囊泡研究最低信息标准》（MISEV2023），“外泌体”这一术语意味着该囊泡是通过内体途径生成的，因此除非有直接证据表明其确实来自内体，否则应谨慎使用这一术语（Kalluri和LeBleu，2020年；Welsh等人，2024年；Witwer等人，2019年）。因此，在本综述中，我们统一使用MSC-EV这一广义术语；而对于那些大小已明确界定、富含外泌体但缺乏内体生成直接证据的制剂，则称其为MSC小型细胞外囊泡（sEVs）。只有在使用原始研究者所用的术语，或已明确证明其生成途径为内体时，才会使用“外泌体”这一术语。与直接使用活细胞相比，间充质干细胞/基质细胞来源的细胞外囊泡（MSC-EVs）可能是一种更为纯净且易于控制的治疗手段，因为无需担心血管捕获、不必要的细胞分化或细胞长期存活的问题（Witwer等人，2019年；Terai等人，2025年）。不过，要使用这类囊泡，仍需对其特性进行详细分析，因为不能仅用“外泌体”这一通用名称来描述EV产品，而应说明其大小、标志物、纯度、分离方法以及可能存在的污染物（Welsh等人，2024年；Witwer等人，2019年）。

在那些修复过程并非由单一途径主导的疾病中，MSC-sEVs的治疗潜力尤为突出。脊髓损伤便是如此——最初的机械性损伤之后，还会出现一个漫长的继发阶段，其中包括神经炎症、氧化应激、血脑脊液屏障功能紊乱、细胞凋亡、髓鞘脱失以及胶质细胞瘢痕形成等现象（Ahuja等人，2017年；Hu等人，2023年）。由于这些病理过程相互交织、彼此影响，有效的治疗方法不仅要能够短暂保护神经元，还要能够抑制有害的炎症反应、维持血管完整性、帮助存活的细胞恢复功能，同时为轴突的生长创造更有利的条件（Ahuja等人，2017年；Hu等人，2023年）。

正是由于存在如此广泛的治疗需求，脊髓损伤便成为测试那些能够同时通过多种机制发挥修复作用的生物活性囊泡的理想研究对象（Bradbury和Burnside，2019年；Cheng等人，2024年；Chen等人，2021年）。

在临床前脊髓损伤模型中，已有研究表明MSC-sEVs能够影响巨噬细胞和小胶质细胞的极化状态、减少细胞凋亡、调节星形胶质细胞的活性、促进血管生成，同时还能够调控与自噬、铁死亡以及轴突再生相关的生物通路（Cheng等人，2024年；Chen等人，2021年；Ye等人，2024年；Yang等人，2024年；Tang等人，2024年）。此外，人们还探索了缺氧预处理、载荷工程改造、鼻腔给药以及基于水凝胶的递送策略，以期提升这些囊泡在目标部位的定位效率、留存时间以及功能恢复效果（Guo等人，2019年；Li等人，2020年；Shimizu等人，2026年）。然而，仅有实验室层面的积极研究成果并不足以支撑实际应用，目前该领域仍然面临着诸多现实挑战，涉及MSC的来源、培养条件、囊泡的分离方法、剂量确定、效力检测、生物分布特性、安全性以及大规模生产等问题（Shimizu等人，2026年）。

因此，本综述旨在系统梳理MSC-EVs，尤其是MSC-sEV制剂在脊髓损伤中的应用情况。我们会汇总目前关于这类囊泡在损伤中的作用靶点、分子修复机制、临床前疗效、递送与生物工程策略以及早期临床研究结果的现有知识，同时重点阐述推动这类技术走向实际临床应用所必需的标准制定、效力检测、生产流程、剂量设定以及试验设计等方面的工作。为提升本综述的实用价值，我们还提出了一套针对脊髓损伤领域的特异性效力检测与报告框架，该框架将MSC-EV产品的身份特征、与作用机制相关的生物学指标、产品释放标准与目前制约不同脊髓损伤研究之间可比性的各种因素联系起来。

以往的综述大多只是列举了MSC来源的sEVs或EVs在脊髓损伤治疗中的各种潜在作用，如抗炎、抗凋亡、促血管生成以及促进组织再生等作用，从而概述其广泛的治疗前景。而本综述的价值在于采用了不同的思路：我们没有将免疫调节、血脑脊液屏障修复、递送方式、剂量选择以及生产制造等因素视为相互独立的议题，而是将它们视为相互关联的发展难题。鉴于有研究表明，系统性给药的MSC-EVs能够改变小胶质细胞的活化状态，经细胞因子预处理的MSC-EVs可能会影响其抗炎效果，而且MSC-sEVs能够在受损的脊髓部位与M2型巨噬细胞结合，同时有助于维持与转化生长因子-β相关的血管稳定性，因此这种分析视角尤为重要。通过将机制层面的证据与递送途径、暴露剂量、效力检测设计、产品释放标准以及脊髓损伤领域的具体应用准备情况相结合，本综述在原有总结的基础上进行了拓展。

章节节选
综述设计
本文采用结构化叙事综述的形式，并结合证据映射分析，而非系统综述或元分析。其目的是综合整理有关MSC-EVs（包括富含外泌体的小型EV制剂）在脊髓损伤中的机制作用、临床前研究结果、递送相关问题、生产制造技术、转化应用前景以及早期临床研究数据。由于该领域在EV的命名方式、分离方法、剂量指标、损伤模型以及疗效评估标准等方面存在较大差异，我们采用了预先设定的证据映射规则——“脊髓损伤中的病理生理靶点：将损伤级联反应与MSC-EV的作用相对应”。脊髓损伤更应被视为一种不断变化的生物性创面，而非单纯的创伤事件（Hu等人，2023年）。最初的冲击会导致轴突断裂、神经元和胶质细胞受损、局部血管功能紊乱以及血脑脊液屏障破裂，但真正的损伤后果往往是在这一初始的机械性损伤之后才逐渐显现的（Hu等人，2023年）。在受损的脊髓组织中，出血、水肿、缺血、离子平衡失调以及兴奋毒性会迅速打破组织的稳态，进而形成不利于组织修复的环境。

MSC-sEV产品的身份特征：来源、载荷成分及特性鉴定
MSC-sEV产品的身份应被定义为与特定来源相关且受制备工艺影响的囊泡制剂，而非简单的“外泌体”类别，因为囊泡的组成会受到母体细胞类型、培养条件以及分离方法的显著影响（Welsh等人，2024年；Witwer等人，2019年；Ding等人，2024年）。对于脊髓损伤研究而言，这一区分尤为重要：骨髓间充质干细胞、人类脐带间充质干细胞以及脂肪来源的间充质干细胞所产生的sEVs，其蛋白质和微RNA的特征可能存在差异，而这些差异又会进一步影响它们的功能。

机制证据：从分子载荷到实际修复作用
如“材料与方法”部分所述，我们依据预先设定的证据映射规则来解读MSC-EVs在脊髓损伤中的作用机制。其中，那些得到行为学恢复改善、组织学结构保留、合适的体外实验验证、充分的囊泡特性分析以及载荷或相关通路的干预证据共同支持的机制，属于高可信度的机制；而那些仅有功能和组织水平上的改善表现，且缺乏合理的分子层面证据支持的机制，则属于中等可信度的机制。

临床前证据：疗效迹象与方法学缺陷
临床前研究为MSC-EVs在脊髓损伤治疗中的有效性提供了可重复的实验依据，但由于损伤模型、EV来源、分离纯化方法、剂量指标、给药时机、给药途径、疗效评估标准以及偏倚控制措施等方面的差异，这些证据的可靠性存在一定限制。目前最一致的观察结果是患者的运动功能有所改善，这类改善通常通过Basso、Beattie和Bresnahan运动评分法或Basso小鼠评分法来进行评估，同时还会观察到损伤区域的体积缩小、炎症程度降低等情况。

递送与生物工程策略
递送方式是决定MSC-EV治疗效果的关键因素，而非仅仅是技术层面的细节。受损的脊髓在解剖结构上处于保护不足的状态，且存在炎症反应、血管稳定性差以及再生能力弱等问题，因此，成功的EV递送策略必须能够确保囊泡能够顺利到达损伤部位、在局部长期停留、持续释放生物活性物质，同时还要保证其安全性。不同的递送途径和生物工程技术可以解决这一问题的不同方面：系统性给药虽然操作简便且重复性好，但容易在器官组织中发生聚集；而鞘内给药则更能直接作用于脊髓内部。

人类研究证据与临床试验准备情况
目前关于MSC-EVs用于脊髓损伤治疗的人类研究证据仍处于初步阶段，这类证据更多体现了该技术的可行性与安全性，而非其确切的治疗功效。目前最具代表性的临床证据是一项首次在人类身上开展的单臂、开放标签I期试验，该试验中，研究人员将同种异体的人类脐带间充质干细胞来源的sEVs（他们将其称为外泌体）给予9名患有完全性亚急性脊髓损伤的患者（Akhlaghpasand等人，2024年）。给药的剂量为300微克总外泌体蛋白，该蛋白悬浮在5毫升磷酸盐缓冲液中后进行鞘内给药。

标准化的转化发展框架
MSC-EVs在脊髓损伤治疗中的应用开发应当以一套系统的开发框架作为指导，而非仅仅是对各种机制或递送技术的简单描述。最关键的一点是在开展疗效测试之前，就必须先明确所研究的产品的具体特征，这包括MSC的来源、供体筛选标准、传代次数范围、培养及预处理条件、EV的分离纯化流程、储存条件、囊泡浓度、大小分布、囊泡与蛋白质的比例以及与囊泡相关的其他特性。

结论与未来展望
MSC-sEVs是一种极具潜力的无细胞治疗候选物质，因为它们能够影响脊髓损伤后继发性损伤的多个相互关联的方面，包括神经炎症、小胶质细胞/巨噬细胞的活化、血管功能紊乱、氧化损伤、胶质细胞的反应性以及有利于组织再生的微环境。不过，目前的证据更多地支持的是一种治疗概念，而非已经明确定义好的临床应用产品。大多数相关数据仍来自临床前研究，而且许多关于其作用机制的论断还需要通过更多的实验来加以验证。

伦理审批与参与者知情同意
不适用。本文是对已有学术文献的综述，并未涉及任何作者开展的新的涉及人类受试者或动物的研究。

关于稿件撰写过程中使用生成式AI及AI辅助技术的声明
在撰写本文时，作者们使用了ChatGPT和Grammarly工具来优化语言表达、提升文本可读性并进行文字编辑。在使用这些工具之后，作者们又对内容进行了必要的审阅和修改，对最终发表文章的内容负全责。

资金支持
本研究未获得任何公共机构、商业机构或非营利组织提供的资助。

作者贡献说明
Jamuna K. V.：研究工作执行；Rhab Mazy Jbar：数据整理；Djaloliddin Mansurov：结果验证；Ulugbek Akhmedov：资金筹集；Divya Singhal：研究指导；Neeraj Bainsal：方法设计及研究工作执行；Laxmidhar Maharana：资源提供；Arwa Omar Al Khatib：初稿撰写及研究构思。

利益冲突声明
作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
无。

利益冲突声明
作者再次声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

术语表
ADSC：脂肪来源的间充质干细胞
AIS：美国脊髓损伤协会功能障碍评分标准
AKTRAC-alpha：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶
ALIXA：ALG-2相互作用蛋白
XARRIVE：动物实验报告规范
BBBBasso Beattie and Bresnahan运动评分法
BDNF：脑源性神经营养因子
BM-MSC：骨髓间充质干细胞
BMS：Basso小鼠评分法
BSCB：血脑脊液屏障
CNS：中枢神经系统
CSF：脑脊液
EV：细胞外囊泡
GFAP：胶质纤维酸性蛋白