Chromate/Fluoro-Jade：一种用于定位石蜡包埋脑组织切片中有髓纤维的高分辨率和对比度荧光染色方法

《Journal of Neuroscience Methods》：Chromate/Fluoro-Jade: a high resolution and contrast fluorescent staining method for localizing myelinated fibers in paraffin embedded brain tissue sections.

　　

研究人员介绍一种独特的用于定位有髓纤维（myelinated fibers）的荧光染料。该染料兼容石蜡包埋（paraffin embedded）组织切片。该染料兼容多种复染方法，包括免疫组织化学（IHC）、尼氏染色（Nissl）和Amylo-Glo。该染料可用于显示正常和病理状态的髓鞘（myelin）。该染料不会随时间褪色或扩散。

**论文解读：Chromate/Fluoro-Jade——一种用于石蜡包埋脑组织切片的高分辨率荧光髓鞘染色方法**

**研究背景与问题**

大脑在宏观上可分为灰质和白质，其中白质主要由有髓纤维（myelinated fibers）构成。髓鞘由少突胶质细胞（oligodendrocytes）的质膜缠绕轴突形成，富含脂质和髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP），能够促进动作电位的跳跃式传导。在神经科学研究中，准确观察有髓纤维的分布对理解脑连接、发育及病理改变至关重要。传统的明场髓鞘染色方法包括亲脂性染料如苏丹黑（Sudan Black）和油红O（Oil Red O），其局限性在于溶解染料的溶剂可能同时提取组织中的脂质；另一类基于铬盐预处理的明场方法（如铁-苏木精染色）虽然稳定，但操作繁琐。荧光髓鞘染色方法虽然更适合多重标记，但现有选择有限：例如FluoroMyelin仅适用于冰冻切片，不能接触溶剂，且标记会随时间扩散；抗MBP免疫荧光方法特异性高但亮度对比度较低，耗时且与溶剂不兼容。因此，开发一种简单、快速、可靠、高对比度、高分辨率且兼容多种多重标记程序的荧光髓鞘染色方法成为迫切需求。

**研究人员的工作与主要发现**

Larry Schmued和Calvert Schmued利用此前用于标记退化神经元的Fluoro-Jade B和Fluoro-Jade C染料，发现将其溶解于酒精溶液中并配合铬酸钾（K₂CrO₄）预处理，能够在石蜡包埋的组织切片中特异性标记有髓纤维。该方法被命名为Chromate/Fluoro-Jade（Cr/F-J）。研究结果表明，Cr/F-J染色能够清晰显示大型有髓纤维束（如胼胝体、纹状体束）以及皮层中细小的单个有髓轴突。该染色具有高亮度和对比度，在室温下储存4个月无褪色或扩散。此外，Cr/F-J与多种复染兼容，包括荧光尼氏染色、淀粉样斑块标记（K114）以及免疫荧光标记（如抗胶质纤维酸性蛋白GFAP的星形胶质细胞标记），可用于观察正常髓鞘和阿尔茨海默病（AD）模型小鼠的髓鞘病变。通过体外MBP结合实验，研究人员证实Cr/F-J的荧光强度与MBP浓度呈正相关，提示其分子靶标可能为MBP。该论文发表在《Journal of Neuroscience Methods》。

**关键技术与方法（不超过250字）**

本研究采用的主要技术包括：（1）样本来源：1岁野生型小鼠和大鼠，以及APP/PS1转基因小鼠（阿尔茨海默病模型）；（2）组织处理：经10%福尔马林灌注固定，石蜡包埋，切片厚度10 μm；（3）Cr/F-J染色：脱蜡水化后，切片在60°C的0.02%铬酸钾（K₂CrO₄）溶液中孵育30分钟，再在含0.0002% Fluoro-Jade C（FJ-C）的45%乙醇中染色20分钟，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后用DPX封片；（4）对照实验：省略铬酸钾预处理或用5(6)-羧基荧光素（carboxyfluorescein）替代FJ-C作为阴性对照；（5）多重标记：分别结合MBP免疫荧光（兔抗MBP抗体+TRITC二抗）、荧光尼氏染色（溴化乙锭，ethidium bromide）、淀粉样斑块标记（K114）、星形胶质细胞免疫荧光（鸡抗GFAP抗体+罗丹明二抗）以及核酸探针Fluoro-Gold；（6）体外结合实验将纯化MBP固定在牛血清白蛋白（BSA）基质中，经Cr/F-J染色后定量荧光强度。

**研究结果**

**Positive and Negative controls:** 通过MBP免疫荧光标记有髓束和单个纤维，亮度对比度中等，远端皮层细纤维不易观察；省略铬酸钾预处理后无任何特异性染色；用羧基荧光素替代FJ-C也无特异性标记，仅见微弱自发荧光，证明铬酸钾预处理和FJ-C对髓鞘标记的必要性。

**Chromate/Fluoro-Jade:** Cr/F-J染色在大鼠前脑冠状切面中显示绿色荧光标记的大型有髓纤维束（胼胝体、纹状体束）以及皮层神经毡中的细小单个有髓轴突，包括所有皮层的放射纤维和第I层的平行纤维。染色在室温保存4个月后无可见褪色或扩散。

**Combined myelin and cell staining:** 将Cr/F-J与溴化乙锭（荧光尼氏染色）结合，可同时定位神经元细胞体（红色）和有髓纤维（绿色）。在海马齿状回中清晰显示苔状纤维与颗粒细胞和多形神经元的关系；扣带回皮层中可见单个放射纤维；脑干腹侧面神经核中的神经元与内侧前脑束的有髓纤维共存。

**Localization of amyloid plaque-related myelinopathies:** 在APP/PS1转基因小鼠（AD模型）皮层中，Cr/F-J与K114（淀粉样斑块标记）共染显示淀粉样斑块（蓝色）周围有髓纤维（绿色）缺失，高倍镜下可见纤维在斑块周围形成膨体并突然终止。加入溴化乙锭复染后可见斑块内及周围缺乏神经元和髓鞘。

**Multiple labeling with immunofluorescent methods:** 在APP/PS1小鼠皮层中进行Cr/F-J与抗GFAP免疫荧光双重标记，可见绿色有髓纤维和红色GFAP阳性星形胶质细胞，肥大星形胶质细胞主要位于皮层和海马。加入Fluoro-Gold进行三重标记可同时显示有髓纤维（绿色）、星形胶质细胞（红色）和细胞核（黄白色）。

**MBP binding studies:** 将不同浓度（0%, 0.1%, 0.2%）的纯化MBP固定在BSA基质中，经Cr/F-J染色后荧光亮度随MBP浓度增加而增强，0.2% MBP样品的荧光强度约为0.1%样品的两倍（标准误差线显示在柱状图中），直接证明Cr/F-J对MBP具有浓度依赖性的亲和力。

**讨论与结论**

讨论部分指出，Cr/F-J染色的分子靶标尚未完全确定，但通过对比实验可推断其机制。与MBP免疫荧光相似的标记模式、体外MBP浓度依赖的荧光增强、以及铬化前组织脱脂后效果更好这些证据支持铬离子与MBP结合，而非传统认为的脂质。阴性对照证实铬酸钾预处理是FJ-C结合的关键，且FJ-C的结合具有特异性，不是普通酸性呫吨类荧光团的共有性质。后续研究可通过生化光谱分析明确铬酸盐与MBP的结合方式，并探索冰冻切片的预处理方法。

研究结论（原文翻译）：本研究首次展示了一种专为石蜡包埋组织切片中有髓纤维荧光定位设计的荧光染料及其配套染色程序。与其他方法（如亲脂荧光染料或MBP免疫荧光）相比，该方法具有快速、灵敏、明亮、存档稳定、兼容溶剂和水性封片剂的优点。该方法还可用于展示髓鞘病变，并能与多种其他组织学方法结合，包括荧光尼氏染色、淀粉样斑块荧光标记和免疫荧光示踪剂。