秋水仙碱作为辅助疗法改善小鼠缺血性卒中再灌注结局

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Colchicine as an Adjunctive Therapy to Improve Ischemic Stroke Reperfusion Outcomes in Mice

　　

背景：机械取栓（mechanical thrombectomy，MT）已成为大血管闭塞所致急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）的基础治疗；然而，不完全的微血管再灌注和血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）破坏常限制其临床获益。新兴证据表明，中性粒细胞驱动的血栓炎症（thrombo-inflammation），特别是中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）介导的微血管阻塞，是再灌注后低灌注（hypoperfusion）和继发性神经血管损伤的关键机制。秋水仙碱（Colchicine），一种经FDA批准的微管抑制剂，可有效抑制中性粒细胞效应功能且安全性良好，因此成为缺血再灌注（ischemia–reperfusion）的有前景的辅助治疗。

方法：研究人员采用短暂性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）小鼠缺血再灌注模型，在再灌注时给予秋水仙碱（0.8?mg/kg，腹腔注射）。在急性期和亚急性期时间点，研究人员评估了循环中性粒细胞反应与活化、中性粒细胞F-肌动蛋白（F-actin）聚合、NET形成、微血管纤维蛋白（原）沉积、脑血流量、白细胞脑部浸润、BBB完整性和神经炎症。在tMCAO后第3天检测了全血吞噬功能和骨髓细胞构成。使用抗Ly6G抗体实现中性粒细胞耗竭。在tMCAO后长达14天内评估了长期神经功能结局和脑组织损失。

结果：在tMCAO小鼠中，再灌注时给予秋水仙碱显著抑制了早期中性粒细胞增加和活化，抑制了中性粒细胞F-actin聚合，并抑制了血管内NET形成和微血管纤维蛋白（原）沉积。它还改善了脑血流量，减少了白细胞脑部浸润，减轻了BBB破坏，并减小了梗死面积。重要的是，秋水仙碱处理的小鼠表现出感觉运动和认知功能的持续改善以及慢性脑组织损失的减少。值得注意的是，秋水仙碱并未加重卒中后免疫抑制，且其神经保护作用在中性粒细胞耗竭后被消除。

结论：再灌注时给予秋水仙碱可抑制中性粒细胞驱动的血栓炎症，保护BBB完整性，并改善脑血流量，从而减轻缺血性卒中后的缺血性脑损伤和长期神经功能缺损。这些发现提示，秋水仙碱可能被开发为一种潜在的辅助疗法，以限制再灌注相关的微血管功能障碍和神经血管损伤。

本研究聚焦于急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）再灌注治疗中的关键难题——尽管大血管再通成功，但微血管再灌注障碍和血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）破坏常导致功能恢复不佳。大量证据指出，中性粒细胞驱动的血栓炎症，尤其是中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）介导的微血管阻塞，是再灌注后低灌注和继发性神经血管损伤的核心机制。目前已有的再灌注疗法如机械取栓（mechanical thrombectomy，MT）虽能快速恢复大血管血流，却难以解决微循环功能障碍。秋水仙碱（Colchicine）作为一种经FDA批准的微管抑制剂，能选择性作用于中性粒细胞，通过破坏微管依赖性细胞骨架动力学，抑制中性粒细胞的极化、趋化、整合素转运、黏附、脱颗粒和NET释放，且安全性良好、成本低廉。因此，研究人员提出假说：在再灌注时给予秋水仙碱，可通过抑制中性粒细胞活化来减轻NET介导的脑血管血栓炎症，进而改善微循环灌注、保护BBB完整性，最终改善神经功能结局。

为验证这一假说，研究人员采用短暂性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）小鼠缺血再灌注模型，在再灌注时给予秋水仙碱，系统评估了其对中性粒细胞动态、F-肌动蛋白（F-actin）聚合、NET形成、局部脑血流量、BBB完整性、脑部白细胞浸润、神经炎症及长期功能结局的影响。主要结论包括：秋水仙碱在再灌注时给药能有效抑制早期中性粒细胞动员和活化，抑制F-actin聚合和NET形成，减少微血管纤维蛋白（原）沉积，从而改善脑血流量；同时减轻脑血管炎症和BBB破坏，减少脑内白细胞浸润和中性粒细胞促炎因子（如IL-1β）产生；且不加重卒中后免疫抑制，不消耗骨髓储备。这些保护效应依赖于中性粒细胞，因为耗竭中性粒细胞后秋水仙碱的神经保护作用消失。长期观察显示，秋水仙碱可减少脑组织损失并持续改善感觉运动功能和空间参考记忆。该研究为“在再灌注时靶向中性粒细胞细胞骨架调控以改善卒中再灌注结局”提供了有力的机制和功能证据，论文发表在《CNS Neuroscience》。

在主要关键技术和样本来源方面：研究人员使用购自杰克逊实验室（Jackson Laboratory）的C57BL/6雄性小鼠（8–10周龄，22–25?g），构建tMCAO模型（50分钟缺血后撤线实现再灌注），在再灌注时腹腔注射秋水仙碱（0.8?mg/kg，经剂量范围实验确定）。采用流式细胞术（flow cytometry）分析外周血和脑内免疫细胞亚群；通过鬼笔环肽（phalloidin）染色评估中性粒细胞F-actin聚合；利用SYTOX Green染色和免疫荧光（CitH3与Ly6G共染）检测NET形成；使用激光散斑对比成像（laser speckle contrast imaging，LSCI）测量局部脑血流量；通过IgG外渗和RT-qPCR评估BBB完整性和黏附分子表达；采用pHRodo荧光底物法检测全血吞噬功能；通过抗Ly6G抗体实现中性粒细胞耗竭；利用改良神经功能缺损评分（modified Neurological Severity Score，mNSS）、黏贴去除实验、足失误实验和Y迷宫测试评估神经功能；使用TTC染色和MAP2免疫染色量化梗死体积和组织损失。

研究结果部分保留原文小标题概述如下：

3.1 Colchicine在tMCAO小鼠中对外周白细胞和脑梗死的最佳剂量范围效应：研究人员通过剂量范围实验发现，秋水仙碱在0.8和1.6?mg/kg时显著减少外周中性粒细胞计数并减小梗死体积，且0.8?mg/kg为最小有效剂量，因此后续实验使用此剂量。

3.2 Colchicine抑制tMCAO诱导的循环中性粒细胞增加和活化：流式细胞术显示，再灌注时给予秋水仙碱在4小时显著降低循环中性粒细胞数量，并部分保留CD62L表达（减少脱落），提示抑制了早期中性粒细胞启动。

3.3 Colchicine抑制tMCAO后外周血中性粒细胞F-actin聚合：通过鬼笔环肽染色和流式细胞术，证实秋水仙碱显著减少了tMCAO诱导的中性粒细胞F-actin聚合增加，表明微管破坏抑制了细胞骨架重塑。

3.4 Colchicine减少tMCAO后NET形成并改善局部脑血流量：SYTOX Green阳性中性粒细胞比例和脑内CitH3+Ly6G+血管内中性粒细胞减少，同时微血管纤维蛋白（原）沉积降低；激光散斑成像显示局部脑血流量在4小时和24小时显著改善。

3.5 Colchicine减轻tMCAO诱导的脑血管促炎活化和BBB破坏：脑微血管RT-qPCR显示黏附分子Icam1、Vcam1、Selp mRNA表达下降，IgG外渗减少，紧密连接相关转录本部分恢复；体外实验表明秋水仙碱无直接内皮保护作用，BBB保护主要源于间接的中性粒细胞抑制效应。

3.6 Colchicine减少tMCAO后脑内白细胞浸润和中性粒细胞促炎活化：流式细胞术发现脑内中性粒细胞、Ly6C^high单核细胞、B细胞和微胶质细胞数量减少，脑浸润中性粒细胞中IL-1β产生下降。

3.7 Colchicine不加重tMCAO后免疫抑制：tMCAO后第3天，全血吞噬功能（中性粒细胞和F4/80+单核细胞）虽有下降，但秋水仙碱未进一步抑制；骨髓细胞构成和中性粒细胞计数与溶剂组无差异。

3.8 Colchicine改善tMCAO后长期神经功能结局并减少脑组织损失：在14天随访中，mNSS、足失误实验和黏贴去除实验均显示感觉运动功能改善；Y迷宫测试中探索新臂时间增加；MAP2染色显示慢性脑组织损失减少。

3.9 Colchicine在tMCAO后的神经保护作用依赖于中性粒细胞：通过抗Ly6G抗体耗竭中性粒细胞后，秋水仙碱不再减少梗死体积或改善神经功能缺损，证实其中性粒细胞依赖机制。

讨论部分总结：本研究表明秋水仙碱作为再灌注时的辅助治疗，可选择性抑制早期系统性中性粒细胞反应、细胞骨架重塑、活化和NET形成，进而减少纤维蛋白相关血管内沉积并改善局部脑灌注。这些上游效应与脑血管炎症减轻、BBB完整性保护、白细胞浸润减少以及缺血脑内中性粒细胞促炎信号抑制相关。中性粒细胞耗竭消除其保护作用，支持中性粒细胞为主要靶细胞。补充性秋水仙碱给药不改变卒中后第3天的全血吞噬功能、骨髓细胞构成和中性粒细胞计数，提示其免疫调控相对安全。最终，秋水仙碱减少了脑组织损失并改善了长期感觉运动和认知恢复。研究结论：综合而言，本研究发现强调了中性粒细胞细胞骨架调控和NET形成驱动的微血管血栓炎症在再灌注后微血管功能障碍、BBB破坏和继发性脑损伤中的关键作用。通过作为病理性中性粒细胞反应的“全细胞骨架刹车”，秋水仙碱可能有助于将大血管再通与微血管衰竭及神经血管损伤分离。这些结果为支持秋水仙碱作为急性缺血性卒中再灌注治疗的潜在辅助疗法提供了强有力的机制和功能证据。