《Nature Biotechnology》：Engineered ADARs enable precision A-to-G base editing of DNA
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摘要：腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editors，ABEs）可实现A•T-to-G•C碱基编辑，是一种具有治疗潜力的强大工具。然而，常规ABEs存在旁观者核苷酸（bystander nucleotide）转换问题，限制了其在精确编辑中的应用。本
摘要：腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editors，ABEs）可实现A•T-to-G•C碱基编辑，是一种具有治疗潜力的强大工具。然而，常规ABEs存在旁观者核苷酸（bystander nucleotide）转换问题，限制了其在精确编辑中的应用。本文研究人员提出了一种单核苷酸分辨率ABE（single-nucleotide resolution ABE，snuABE），通过将切口酶Cas9（nickase Cas9，nCas9-H840A）与作用于RNA的腺苷脱氨酶（Adenosine Deaminase acting on RNA，ADAR）脱氨酶结构域融合构建而成，该ADAR结构域作用于DNA:RNA杂合双链，而非常规ABEs中所用的作用于单链DNA的TadA脱氨酶。snuABE需要一条靶腺嘌呤向导RNA（target-adenine guide RNA，tagRNA），其在靶腺嘌呤处引入错配，使ADAR能够高度特异地催化A-to-G编辑。研究人员利用基于计算机的蛋白质进化算法EvolvePro对来自人虱（Pediculus humanus）的ADAR进行工程化改造，并结合tagRNA的3′端保护，增强了snuABE活性，在HEK293T细胞的32个靶点上中位编辑效率达5.4%，最高达50.0%。snuABE在预测的脱靶位点或正交R-loop位点上未检测到可检测的DNA脱靶编辑，凸显了其作为一种精确且安全的碱基编辑技术的潜力。
研究背景与意义
传统CRISPR-Cas9核酸酶引入DNA双链断裂（Double-Strand Breaks，DSBs）易导致大片段缺失、染色体异常及p53介导的细胞死亡，不适用于需精确碱基纠正的遗传病治疗。腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editors，ABEs）可在不引入DSBs的情况下实现A•T-to-G•C转换，但受限于编辑窗口内的旁观者编辑（bystander editing，同一窗口内非目标腺嘌呤被意外编辑）及DNA/RNA脱靶效应，且缩小编辑窗口往往牺牲效率，难以兼顾单碱基精度与活性。ADAR（Adenosine Deaminase acting on RNA）天然识别双链RNA中错配腺嘌呤并催化A-to-I（转录后视为G）编辑，既往仅用于RNA编辑工具（如REPAIR、LEAPER）。本研究首次将ADAR脱氨酶结构域（ADAR deaminase domain，ADARdd）重用于哺乳动物细胞DNA编辑，利用nCas9-H840A形成R-loop暴露DNA链与tagRNA（在其3′端延伸序列引入靶A错配）形成DNA:RNA杂合双链，使ADARdd选择性脱氨靶链错配A，实现单核苷酸分辨率A-to-G编辑（A•T→G•C），相关成果发表于《Nature Biotechnology》。
主要关键技术方法
研究人员采用以下关键方法开展研究：（1）构建融合蛋白文库：将多种物种ADARdd（含人hADAR2dd E488Q突变体及20种真核生物同源ADARdd引入保守E→Q活化突变）N端或C端融合至nCas9-H840A（切口酶Cas9，H840A突变）及dCas9，筛选最优PhADARdd（人虱Pediculus humanus ADARdd）；（2）设计专用tagRNA：在sgRNA 3′端延伸15–69 nt并在靶A对应位置配对C以形成A:C错配，测试不同长度及错配碱基要求；（3）蛋白工程优化：借鉴PEmax策略引入核定位信号（NLS）及nCas9点突变（R221K、N394K），C端融合La蛋白截短体La(1–194)保护tagRNA 3′端，利用AI驱动定向进化算法EvolvePro对PhADARdd进行单点及组合突变筛选；（4）辅以错切gRNA（nicking gRNA，ngRNA）在互补链引入切口及共表达错配修复抑制因子MLH1-SB增强编辑效率；（5）评估指标：在HEK293T等细胞系及病人来源成纤维细胞/iPS细胞中靶向AAVS1、FANCF、DNMT1、VHL、PCSK9、BCL11A等内源位点，通过高通量扩增子测序分析A-to-G编辑效率、旁观者编辑率、indel频率、DNA脱靶（Cas-OFFinder预测位点及正交R-loop实验）及RNA脱靶（全转录组RNA-seq比对REDIportal数据库）；（6）体内验证：小鼠尾静脉水动力注射递送snuABE4.2n质粒靶向小鼠Gcnt4内含子。
研究结果
Operating concept of snuABE using ADAR and a dedicated gRNA
研究人员构建hADAR2dd(E488Q)-nCas9-H840A融合蛋白（snuABE1.0）配合含3′端24 nt延伸且在靶A处引入A:C错配的tagRNA。在FANCF位点，传统ABE8e于A12/A13/A18均产生编辑（最高61.0%），而snuABE1.0仅编辑A12（1.1%），证实ADARdd可在活细胞DNA:RNA杂合双链中选择性脱氨错配A。跨物种筛选22个ADARdd同源蛋白并引入E→Q活化突变后，人虱PhADARdd在AAVS1（6.0%）和FANCF（0.7%）表现最优，命名为snuABE2.0。
3′-end protection of tagRNA increases snuABE editing efficiency
借鉴引物编辑（Prime Editing，PE）优化策略，snuABE2.1引入SV40内部NLS、nCas9-H840A双点突变（R221K、N394K）及C端c-Myc NLS；共表达La或截短La(1–194)使AAVS1和FANCF编辑提升。将La(1–194)直接C端融合得snuABE3.0（AAVS1 16.5%，FANCF 8.5%），进一步整合PEmax修饰得snuABE3.1（AAVS1 20.0%，FANCF 12.1%）。在DNMT1位点设计不同位置错配的tagRNA，snuABE3.1可随tagRNA错配位置切换选择性编辑A13或A15，而所有常规ABEs（ABEmax、ABE8e、ABE9及旁观者减少变体ABEx1–ABEx4）均在窗口内多A编辑，证明snuABE具单核苷酸选择性。
Characterization of optimized conditions of snuABE3.1
tagRNA 3′延伸24–33 nt时效率最高；snuABE3.1主要产生A-to-G转换，indel <1%；仅tagRNA中与靶DNA-A配对的碱基为C时可高效编辑（A:C错配），其他碱基或凸起无活性；有效编辑窗口为protospacer第12–16位（偏好A/T-5′及C/G-3′侧翼，中位效率2.1%但受更广序列背景影响）。
Determination of off-target effects on genome and transcriptome
Cas-OFFinder预测6个AAVS1潜在脱靶位点ABE8e有明显脱靶编辑，snuABE3.1无可检测DNA脱靶；正交R-loop（dSaCas9诱导人工R-loop）实验显示snuABE3.1无Cas9非依赖DNA脱靶脱氨。RNA层面，snuABE3.1在已知内源ADAR热点有轻微A-to-I编辑，全转录组RNA-seq显示RNA脱氨水平高于snuABE1.0（人ADAR2dd）但低于ABE8e。
Enhancing editing efficiency of snuABE through AI-based directed evolution
AlphaFold3建模显示PhADARdd N端flap可能非必需，截去N端10 aa（snuABE4.0）活性提升。用EvolvePro以5个多样基序靶点为训练集进行多轮单点突变筛选及组合预测，最终获三突变体PhADARdd(E438Q,I536S,E637F)，即snuABE4.1，中位编辑效率由snuABE3.1的2.1%升至4.8%，且在5′-G侧翼等非优选基序也有改善；建模提示I536S/E637F靠近DNA–RNA结合环而非催化中心，可能通过稳定DNA:RNA杂合底物增强活性。
MLH1-SB (small binder) and additional nick further enhance editing efficiency of snuABE
共递送互补链ngRNA（snuABE4.1n）使32靶点中位效率升至5.4%；ngRNA位置影响效率与indel，需优化。共表达错配修复（Mismatch Repair，MMR）抑制因子MLH1-SB（snuABE4.2）在MMR proficient细胞（HEK293、HeLa、U2OS）显著提升效率，MMR deficient HEK293T中无影响。联合ngRNA与MLH1-SB得snuABE4.2n。在病人来源成纤维细胞（AAVS1最高16.3%）和iPS细胞（AAVS1 1.4%）中验证有效；兼容SpCas9-NG及近PAMless SpRY变体（效率略降但可工作）。snuABE4.1 DNA脱靶检测同snuABE3.1——无可检测gRNA依赖/非依赖DNA脱靶；RNA脱靶总数较snuABE3.1增加但未选择性富集内源A-to-I编辑位点。
Precise adenine correction in genetic disease models by snuABE
VHL综合征模拟细胞（c.332G>A突变）中，常规ABEs伴严重旁观者编辑，snuABE4.1n实现无旁观者单A编辑效率最高63.6%。HeLa细胞中snuABE4.2靶向PCSK9外显子剪接供体位点A-to-G转换达10.5%（ exon1）和12.3%（exon4）。K562细胞中snuABE4.2n靶向BCL11A +55红系增强子A-to-G编辑达18.1%。小鼠尾静脉水动力注射snuABE4.2n靶向肝Gcnt4位点，7天后肝脏平均编辑效率2.0%，无相邻A旁观者编辑。
讨论与结论总结
传统ABEs虽高效但受旁观者编辑限制，已有TadA工程、sgRNA修饰及辅因子融合等策略未能实现真正单碱基精度。本研究开发的snuABE利用tagRNA在靶A处刻意引入A:C错配使ADARdd仅作用于该错配A，几乎消除旁观者编辑；因需tagRNA与靶序列完全互补（类似pegRNA），DNA脱靶极低。研究人员通过借鉴PEmax修饰、La(1–194)融合保护tagRNA 3′端、AI驱动EvolvePro进化PhADARdd、互补链切口（ngRNA）及MMR抑制（MLH1-SB）逐步优化至snuABE4.2n。局限性包括整体效率仍低于ABE8e、残存序列偏好及RNA脱靶随DNA活性同步升高（工程增益的权衡）。兼容PAM宽松Cas9变体为扩靶提供可能但需进一步酶动力学优化。与引物编辑相比，snuABE tagRNA设计更简单（仅需优化3′延伸长度24–32 nt），编辑窗口位于protospacer 12–16位，在VHL疾病模型中达无旁观者高效纠正并经小鼠体内验证。未来需通过进一步ADAR工程降低RNA脱靶及优化LNP/病毒样颗粒体内递送。综上，snuABE代表一种高特异性、低DNA脱靶的A-to-G碱基编辑新范式，适用于传统ABE因旁观者效应无法安全编辑的致病位点，拓展了精确基因组修正的治疗工具箱。
