骨骼疾病的细胞和遗传决定因素的多尺度分析与功能验证

《Nature Genetics》：Multiscale analysis and functional validation of the cellular and genetic determinants of skeletal disease

　　

肌肉骨骼疾病是主要的健康负担。骨活性疗法的开发受到对调节骨骼的细胞和基因有限理解的阻碍。研究人员利用跨物种分析的价值，并在骨骼组织中开发了单细胞方法学，以定义调节骨转换的关键骨内膜区室。共识别出34种不同的细胞类型，并通过在扩展的UK Biobank全基因组关联研究（GWAS）中富集罕见骨骼疾病基因和骨矿物质密度（BMD）相关基因，对疾病相关细胞进行了优先排序。在超过1,000个基因修饰小鼠模型中进行了功能验证。内皮细胞（ECs）和血管平滑肌细胞（VSMCs）与成骨细胞、软骨细胞和破骨细胞谱系一起被确定为新的骨骼疾病相关细胞。识别出数百个在骨骼病理生理学中作用未被充分认识的细胞特异性基因。这一全面的细胞和分子框架支撑着骨骼生理学和疾病，并将有助于优先确定新的治疗靶点，以加速治疗肌肉骨骼疾病的疗法开发。

**研究背景与问题**
肌肉骨骼疾病（如骨质疏松症）是重大健康负担。现有治疗可防止骨骼恶化，但很少恢复完整性，新疗法需求迫切。然而，药物开发受限于对维持骨量和强度机制的有限理解。罕见和常见疾病的基因定位揭示了骨骼调节的新机制，全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出超过500个与骨矿物质密度（BMD）相关的位点，但大多数位点的效应基因（对骨骼调节有功能性作用的基因）仍然未知。批量组织的表达数量性状位点（eQTL）分析可识别效应基因，但受限于对特定细胞中基因功能的有限认识。将eQTL方法应用于单细胞转录组学具有潜力，但从健康个体获取骨细胞（尤其是骨内膜区室细胞）非常困难，该区室是骨转换的关键部位，位于骨与骨髓（BM）界面。因此，骨细胞在人类细胞图谱和基因型组织表达项目中代表性不足。由于人类和小鼠基因高度保守，研究人员推测从小鼠骨内膜区室分离细胞可解决这些挑战。

**开展的研究与结论**
研究人员假设，将从小鼠骨骨内膜区室分离的细胞图谱的基因表达数据与人类罕见和常见骨骼疾病性状的基因定位研究相结合，可识别致骨骼疾病的效应基因。他们生成了健康小鼠骨内膜区室的单细胞RNA测序（scRNA-seq）图谱，并与以下分析整合：(1) 罕见骨骼疾病分类学；(2) 新的且目前最大的BMD的GWAS；(3) 小鼠基因组信息学（MGI）数据库的骨骼表型数据；(4) 对超过1,000个基因缺失小鼠品系的深入骨骼功能分析；(5) 人类骨scRNA-seq数据集的验证结果。这一多尺度方法定义了骨内膜区室的细胞景观，并识别了成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞、血管平滑肌细胞（VSMCs）和内皮细胞（ECs）中的效应基因，这些基因导致骨骼疾病。结论是，该综合细胞和分子框架为理解骨骼生理学和疾病奠定了基础，有助于优先确定新治疗靶点以加速疗法开发。该论文发表在《Nature Genetics》。

**主要技术方法**（不超过250字）
研究人员开发了单细胞方法学，从小鼠股骨骨内膜区室（干骺端和骨干）及骨髓分离细胞进行scRNA-seq（5次独立实验，每次5个生物学重复），识别出34个细胞簇。对非造血细胞进行高分辨率亚聚类（16个亚簇）和单核ATAC测序（snATAC-seq）以定义分化状态和转录因子。人类来源为圣文森特医院悉尼分院骨关节炎患者股骨头样本。大规模GWAS数据来源于UK Biobank（448,010例欧洲血统参与者）进行BMD关联分析和MAGMA基因水平测试。利用超过1,000个小鼠基因敲除品系（来源：帝国理工学院和惠康信托桑格研究所小鼠遗传学项目）进行OBCD骨骼表型筛选（19个参数）。斑马鱼胚胎（Tg(kdrl:EGFP)品系）用于pls3敲除验证。空间转录组数据用于人类验证（已发表数据集）。

**研究结果**（保留每个小标题）
**Cells in the endosteal compartment**（骨内膜区室中的细胞）
通过scRNA-seq分析133,942个小鼠细胞，鉴定出34个细胞簇，分为六大类。非造血细胞（软骨细胞、成骨细胞谱系、ECs、VSMCs）主要来自骨内膜区室。成骨细胞基因程序包含577个基因，其中79个高度上调（log₂(fold change) > 2），387个（67.1%）未被Gene Ontology（GO）数据库或MGI数据库注释为骨骼相关。ECs和VSMCs基因程序中分别有26.9%和27.7%的高表达基因与骨骼生物学过程注释相关。细胞-细胞相互作用分析显示非造血细胞间（尤其是成骨细胞谱系与血管系统）相互作用最强。

**Cell states in the endosteal compartment**（骨内膜区室中的细胞状态）
对非造血细胞进行高分辨率亚聚类，识别出16个亚簇。成骨细胞谱系形成连续分化过程：间充质基质细胞（MSCs）→成纤维细胞→骨祖细胞→前成骨细胞→成熟成骨细胞→早期骨细胞。通过SCENIC分析识别关键转录因子（如Cebpa、Foxc1、Runx2、Sp7）及其靶基因。snATAC-seq鉴定出新的转录因子（如Ebf3、Maz、Ctcfl）。软骨细胞、ECs、VSMCs也呈现不同分化阶段。56.3-72.6%的成骨细胞谱系基因未被GO或MGI数据库注释。

**Enrichment of rare skeletal disorder genes**（罕见骨骼疾病基因的富集）
利用国际骨骼发育不良学会分类（528个蛋白编码基因）进行过表达分析。成骨细胞谱系、软骨细胞、破骨细胞、增殖性单核细胞和增殖性前B细胞显著富集致病基因。成骨细胞谱系主要富集引起成骨不全（OI）及骨硬化疾病的基因（61/553个人类直系同源基因）。软骨细胞富集蛋白聚糖核心蛋白疾病和硫酸化疾病等基因。破骨细胞富集骨硬化症和骨溶解相关基因。

**Enrichment of genes associated with eBMD**（BMD相关基因的富集）
通过GWAS（448,010人）识别169,684个全基因组显著变异（P < 6.6×10^-9），精细映射出1,294个独立先导变异（最接近903个蛋白编码基因）。MAGMA基因水平测试发现3,883个基因与BMD关联。竞争性基因集分析显示成骨细胞谱系、软骨细胞、ECs和VSMCs的基因程序富集BMD相关基因。条件分析表明富集并非由共享基因混淆。

**Enrichment of eBMD effector genes known to regulate bone**（已知调节骨的BMD效应基因的富集）
利用MGI数据库中“异常骨结构”表型基因（1,347个蛋白编码基因）进行富集分析。成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞和VSMCs（而非ECs）的基因程序高度富集，且当仅限于BMD相关基因时富集增强。排除单基因疾病基因后，成骨细胞、软骨细胞和VSMCs的富集仍存在。

**New eBMD effector genes regulate structure and function**（新的BMD效应基因调节结构和功能）
对超过1,000个基因敲除（KO）小鼠品系进行骨骼筛检。在五个细胞程序的1,886个基因中，101个（5.3%）有KO品系，其中51个（50.5%）表现出异常骨结构、功能或骨质量表型。包括已知基因Bgn、Crebl1、Gpc6、Pls3，以及新基因Ptprd、Nherf2、Cbx6、Agap1等。

**PLS3**
对Pls3缺陷雄性小鼠（Pls3^y/?）的研究显示：腰椎和长骨骨矿物含量（BMC）降低，骨体积分数、骨小梁厚度减少，皮质厚度降低，生物力学强度受损。骨切片显示皮质孔隙增加、血管腔隙增大。斑马鱼胚胎中pls3敲低导致血管形成缺陷（节间血管断裂、异位连接、管腔变小），提示X连锁骨质疏松可能源于骨血管异常。

**Restricted eBMD genes**
对表达受限基因Ptprd（成骨细胞谱系限制性）、Nherf2（ECs限制性）、Cbx6（VSMCs限制性）、Agap1（破骨细胞限制性）的KO小鼠进行分析，均表现出不同程度的结构异常：Ptprd^?/?小鼠股骨骨小梁减少；Nherf2^?/?小鼠股骨骨小梁减少；Cbx6^?/?小鼠股骨皮质厚度和强度下降；Agap1^?/?小鼠股骨和椎骨BMC、骨小梁、皮质厚度及强度均下降。

**Cells and genes involved in skeletal diseases in human bone**（人类骨中参与骨骼疾病的细胞和基因）
从人类股骨头分离125,063个细胞进行scRNA-seq，识别出与小鼠相似的细胞群（MSCs、前成骨细胞、成熟成骨细胞、软骨细胞、ECs、VSMCs等）。人类细胞基因程序同样富集单基因骨骼疾病基因和BMD相关基因。82-100%在小鼠中验证的效应基因也在人类对应细胞中表达（如PLS3、PTPRD等）。空间转录组数据进一步验证了上述结果（成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞基因程序富集疾病基因，VSMCs富集BMD基因，脂肪细胞无富集）。

**A platform for data interrogation**（数据查询平台）
研究人员开发了整合上述数据的网络平台（www.musculoskeletal-genomics.org），使用户能够识别效应基因并定义其作用的细胞。

**讨论总结与研究结论翻译**
讨论部分指出：本研究利用单细胞技术解决了骨骼研究因矿化组织挑战而滞后的问题。研究定义了骨内膜区室的细胞及其基因程序，验证了成骨细胞、软骨细胞和单核/巨噬/破骨细胞谱系的关键作用，并识别了ECs和VSMCs这类被低估的细胞类型。骨骼疾病病理机制可能是谱系限制性的，或涉及多种细胞类型，甚至复杂的全身效应。研究局限性包括：未包括骨膜，可能未捕获脆弱的细胞（如脂肪细胞、成熟骨细胞），仅研究股骨，BMD GWAS局限于欧洲血统人群，且未涵盖所有候选基因的KO品系。研究结论翻译如下：总之，本研究整合了来自人类、小鼠和斑马鱼的遗传、转录和功能数据，确定了一个新的细胞和分子框架，通过该框架可以理解骨骼生理学和疾病。这些数据对骨骼发育、罕见骨病、衰老以及骨骼对全身疾病（包括恶性肿瘤和炎症）的反应具有重要意义。这一基础性知识将有助于识别治疗骨骼疾病的治疗靶点。