遗传工具箱扩展实现鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)组成型荧光标记以用于功能微生物组学研究

《Microbial Biotechnology》：Genetic Toolbox Expansion Enables Constitutively Fluorescent Lacticaseibacillus rhamnosus for Functional Microbiome Research

　　

摘要：鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus，原Lactobacillus rhamnosus）菌株因其益生菌潜力及在泌尿生殖系统和肠道健康中的作用而被广泛认可，但其遗传可操作性（genetic tractability）及可用遗传工具仍有限，阻碍了功能微生物组学研究和合成生物学应用。本研究通过实现直接质粒克隆（direct plasmid cloning）并测试一套早先在植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）中验证过的遗传元件，扩展了广泛使用的益生菌株——鼠李糖乳酪杆菌GR-1和鼠李糖乳酪杆菌GG（L. rhamnosus GG）的遗传工具箱。在5个组成型启动子（PtlpA、Ptec、Pcpg、P48和P23）中，PtlpA在L. rhamnosus GR-1中显示出强启动子活性。研究人员进一步通过引入阻遏蛋白（repressor）、评估其天然温敏响应性及随时间稳定性对该启动子功能进行了表征，以增强其工业应用潜力。利用这些工具，研究人员用mCherry、mScarlet3和sfGFP（superfolder Green Fluorescent Protein）的组成型荧光对L. rhamnosus GR-1进行了工程改造。组成型荧光L. rhamnosus GR-1菌株的功能通过在概念验证生长竞争实验中对荧光标记的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）进行追踪得以证实。这些组成型荧光L. rhamnosus菌株及扩展的遗传工具包为研究黏、微生物—微生物及宿主—微生物互作等功能特性，以及将乳杆菌科（Lactobacillaceae）推进为合成生物学底盘（chassis）提供了宝贵资源。

论文解读：遗传工具箱扩展实现鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)组成型荧光标记以用于功能微生物组学研究

研究背景与立项依据

乳杆菌科（Lactobacillaceae），特别是鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus，下称L. rhamnosus）GR-1和GG菌株，因其在阴道、肠道、皮肤及呼吸道的健康益处被广泛研究，是具有潜力的活体治疗产品（Live Biotherapeutic Product, LBP）及合成生物学底盘（chassis）。然而，相较于大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），L. rhamnosus的遗传工具箱十分有限，缺乏强组成型启动子（constitutive promoter）及适用于该菌系的荧光报告系统，传统使用的NICE（Nisin Controlled Expression）诱导系统存在本底泄漏（leaky expression）、需外源诱导剂及双质粒组成等局限，且既往测试的源自L. rhamnosus自身的启动子（如P_msp1、P_apf）表达水平较低，常规GFP在L. rhamnosus GG中无法检测到荧光。此外，不同乳酸菌物种间遗传元件存在宿主特异性，跨物种移植效果未知。因此，扩展L. rhamnosus适用的遗传元件（启动子、阻遏蛋白、荧光蛋白）并建立组成型荧光标记菌株，对解析益生菌黏附、定植及菌群互作机制至关重要。本文发表在《Microbial Biotechnology》。

主要关键技术方法

研究人员从已植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum WCFS1）中验证的元件中选取5个组成型启动子（P_tlpA源于Salmonella enterica serovar Typhimurium、P_tec源于Lactobacillus delbrueckii侵染噬菌体Mv4、P_cpg源于L. plantarum侵染噬菌体Φg1e、合成启动子P₄₈及乳酸球菌来源P₂₃），克隆至含mCherry及低拷贝p256质粒骨架中，电转化入L. rhamnosus GR-1和GG评估启动子强度；采用HiFi DNA Assembly构建含Rep阻遏蛋白（源于Mv4噬菌体）及P_tlpA侧翼操纵子位点的调控质粒；用Synergy HTX酶标仪测定相对荧光单位（RFU/OD₆₀₀），用荧光显微镜观察mCherry、mScarlet3及sfGFP（superfolder Green Fluorescent Protein）；通过3天连续传代实验评估质粒保留率及荧光稳定性；用带GFP的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus NR-51163 pSGFPS1）与荧光L. rhamnosus GR-1进行共培养竞争实验，分别检测OD₆₀₀、GFP及mCherry荧光追踪各自生长动力学，并以CFU计数和斑点抑菌实验验证抑菌活性。

研究结果

3.1 Identification of a Strong Constitutive Promoter for L. rhamnosus（L. rhamnosus强组成型启动子的鉴定）

研究人员将5个启动子分别连接mCherry报告基因转入L. rhamnosus GR-1和GG，通过酶标仪检测相对mCherry荧光。结果显示P_tlpA和P₄₈在两种菌株中均有显著活性（p<0.05），P_tec、P_cpg、P₂₃无 detectable信号。其中P_tlpA活性最强，在L. rhamnosus GR-1中较L. rhamnosus GG高8.6倍，较作为参照的诱导型P_nisA（NICE系统）在GR-1中高约20倍，菌落呈肉眼可见红色。3天选择性及非选择性连续传代显示P_tlpA驱动的mCherry表达稳定，质粒保留率无显著下降；温敏实验表明P_tlpA在37℃时活性最高，30℃和33℃显著降低（p<0.005），39℃亦降低（p<0.05），符合其源于沙门氏菌温敏调控tlpA操纵子的特性。结论：P_tlpA是L. rhamnosus GR-1中高效、稳定、具生理温度最适性的强组成型启动子。

3.2 Repressing the Expression Levels of P_tlpAPromoter in L. rhamnosus GR-1（L. rhamnosus GR-1中P_tlpA启动子表达水平的阻遏）

研究人员构建含Mv4噬菌体来源Rep阻遏蛋白（由中等强度P₄₈驱动）及P_tlpA侧翼Rep结合操纵子位点的质粒转入L. rhamnosus GR-1。结果显示单独引入操纵子序列使mCherry荧光降24.4倍（可能干扰启动子-35/-10区或5′ UTR），共表达Rep阻遏蛋白后mCherry荧光较仅含P_tlpA-mCherry菌株降低94.7%（泄漏表达约5.3%），且Rep表达对细菌生长曲线几无影响，24小时动态监测显示阻遏效果持续稳定。结论：Mv4噬菌体Rep阻遏蛋白–操纵子系统可在L. rhamnosus GR-1中有效抑制P_tlpA，可纳入该菌遗传工具箱用于基因表达精细调控。

3.3 Generation of Additional Fluorescent L. rhamnosus GR-1 Strains Producing mScarlet3 and sfGFP（构建表达mScarlet3和sfGFP的额外荧光L. rhamnosus GR-1菌株）

以强P_tlpA驱动mScarlet3（改良红荧光蛋白）和sfGFP基因，构建重组质粒转化L. rhamnosus GR-1，荧光显微镜观察。结果显示野生型无自发荧光，而工程菌株在TexasRed滤光片下清晰可见mCherry和mScarlet3红色荧光，FITC滤光片下可见sfGFP绿色荧光。结论：首次在L. rhamnosus GR-1中实现P_tlpA驱动的组成型mScarlet3与sfGFP功能性表达并可经荧光显微镜分辨，拓展了多色荧光标记能力。

3.4 Fluorescent L. rhamnosus GR-1 for Investigating Microbe-Microbe Interactions and Bacterial Population Dynamics（荧光L. rhamnosus GR-1用于研究微生物—微生物互作及菌群动态）

将mCherry标记的L. rhamnosus GR-1 pAMB6500与GFP标记的致病菌S. aureus NR-51163共培养24小时，分别检测OD₆₀₀、GFP（追踪S. aureus）和mCherry（追踪L. rhamnosus）。结果显示工程菌株与野生型L. rhamnosus GR-1生长无显著差异（质粒负荷小），共培养中S. aureus的GFP信号及终末CFU显著低于单培养（p<0.00005），L. rhamnosus终末CFU不受影响，斑点实验显示野生型与工程菌株产生相当抑菌圈（~23 mm），证实L. rhamnosus对S. aureus具抑菌活性且荧光标记不影响此特性；mCherry信号在单培养和共培养中均可被区分追踪。结论：组成型荧光标记允许在混合培养中实时、独立追踪各菌株生长动态，克服了OD无法区分菌种的限制，适用于功能微生物组互作研究。

讨论与结论总结

讨论指出本研究通过跨物种测试将L. plantarum中验证的遗传元件成功移植至L. rhamnosus，强调了乳酸菌遗传工具需菌株特异性定制。P_tlpA在GR-1中活性显著高于GG及既往NICE系统，且具温敏性和传代稳定性；Mv4 Rep阻遏系统在L. rhamnosus中可达>94%抑制，为基因回路构建提供基础；首次在L. rhamnosus GR-1中实现组成型mScarlet3和sfGFP可视化，克服以往诱导系统需外源添加及内源启动子弱表达的局限；竞争共培养证明荧光标记可用于菌群互作定量解析。作者也指出当前使用含红霉素抗性基因质粒限制临床转化，未来应朝染色体整合及无抗生素筛选（营养缺陷型、毒素—抗毒素系统等）方向发展。

结论（翻译）：

总体而言，研究结果凸显了L. rhamnosus GR-1和L. rhamnosus GG在基础微生物组学及应用合成生物学中的潜力。早先在模式菌L. plantarum WCFS1中验证的数种工具现于具工业与医疗价值的L. rhamnosus GR-1和GG中得到评价。因菌株特异性功能差异，本研究阐明建立通用乳杆菌科遗传工程工具箱之挑战，强调针对特定菌株定制遗传元件之必要性。研究人员获得了适用于L. rhamnosus GR-1和GG的多个强度组成型启动子（含强P_tlpA），利用该启动子建立了功能性阻遏系统，并构建了组成型红色（mCherry和mScarlet3）及绿色（sfGFP）荧光L. rhamnosus GR-1菌株。这些遗传工具可对该非模式生物进行精确有效的工程改造，从而提升其工业潜力并促进功能微生物组学研究。