基于双模式纳米酶印迹拭子传感器并结合图像分析技术，实现对糖尿病酮症酸中毒生物标志物的无创高灵敏度检测

《Sensors and Actuators A: Physical》：Noninvasive and ultrasensitive detection of diabetic ketoacidosis biomarkers based on a dual-mode nanozyme-imprinted swab sensor with image-assisted analysis

　　

Zhihui Liao|Ao Ma|Yujin Ouyang|Xuyun Liu|Qiuyu Wu|Jianmei Wu|Zhaoxia Yang|Zhaohui Zhang

中国湖南省吉首市吉首大学药学科学学院，邮编416000

摘要

糖尿病酮症酸中毒是一种可能致命的代谢性疾病，快速、无创地检测其生物标志物对于早期预警和监测至关重要。本研究开发了一种基于拭子的双模式纳米酶印迹传感器，结合算法辅助的图像分析技术，能够快速同时检测唾液和汗液中的糖尿病酮症酸中毒生物标志物——丙酮和β-羟基丁酸。该传感器在拭子两端固定了两种基于沸石咪唑酯框架-67的分子印迹纳米酶，目标物质与这些纳米酶结合后会降低其过氧化酶样活性，从而引发明显的比色和荧光信号变化。通过智能手机成像与算法分析相结合，可在15分钟内完成图像采集和定量分析。在比色模式下以灰度值作为定量参数，在荧光模式下则以RGB颜色值比作为定量依据，无需精密仪器即可实现检测。该印迹传感器在0.01-10毫摩尔的浓度范围内具有良好的线性响应，比色分析的检测限分别为0.289微摩尔（丙酮）和0.0214微摩尔（β-羟基丁酸），荧光分析的检测限则为0.118微摩尔（丙酮）和0.0125微摩尔（β-羟基丁酸）。这一平台可成功用于同时检测唾液和汗液中的丙酮和β-羟基丁酸，为糖尿病酮症酸中毒生物标志物的快速、无创、便携式现场检测提供了有效方法。

引言

糖尿病酮症酸中毒是一种严重的急性糖尿病并发症，临床表现为代谢性酸中毒和过多酮体积累，若不及时干预，病情会迅速发展为严重脱水甚至死亡。在各类酮体中，β-羟基丁酸和丙酮是最具代表性的生物标志物，能够反映疾病的严重程度和全身代谢状况。同时检测这两种物质对于全面评估糖尿病酮症酸中毒非常重要。目前常见的检测方法主要是通过酶法分析或复杂的色谱/质谱技术对血液或尿液进行检测，这类方法往往具有侵入性、成本较高，且不适合现场检测。而唾液和汗液则是颇具潜力的无创替代检测样本，因为其中的丙酮和β-羟基丁酸浓度与全身代谢状态密切相关。此外，同时检测两种生物流体中的相关物质还可以相互验证结果，减少基质干扰，提供更全面的代谢信息，从而提高疾病评估的准确性。不过，目前仍难以实现在这类生物流体中同时对这两种生物标志物进行定量检测。因此，开发适用于唾液和汗液的无创检测方法，对于快速筛查和监测糖尿病酮症酸中毒生物标志物具有重要意义。

毛细作用驱动的传感平台因其极低的样本消耗量、快速的响应速度以及出色的便携性，非常适合用于现场检测。尤其是那些利用毛细作用实现无需外部动力即可自动输送液体的纤维基系统，更具备强大的现场分析能力。医用拭子作为一种随处可见且成本低廉的纤维基工具，能够同时实现样本采集和信号生成，相比传统的纸质检测装置，更能提升用户的使用依从性。然而，目前大多数基于拭子的传感器都采用单端结构且仅有单一检测模式，无法实现多种分析物的同时检测。除了结构上的缺陷，独立的光学检测方法在分析复杂生物流体时也存在局限性：比色法虽然能快速给出视觉结果，但易受干扰；而比率荧光法虽能实现可靠的定量分析，却无法提供直观的视觉信号。

为了在唾液、汗液等复杂样本中实现可靠的现场检测，高度选择性地识别目标分析物至关重要。分子印迹聚合物凭借其定制化的结合位点，具备出色的选择性识别能力。与传统的自由基聚合分子印迹聚合物相比，溶胶-凝胶法制备的分子印迹聚合物具有更高的化学稳定性、更均匀的结合位点以及更快的质量传递效率。此外，将这类溶胶-凝胶法制备的分子印迹聚合物与过氧化酶样纳米酶结合使用，可实现特定的分子识别，显著提升对微量物质的检测灵敏度。

为了将分子印迹聚合物纳米酶系统产生的高选择性生化信号转化为用户易于理解的诊断结果，基于智能手机的图像分析技术已成为现场检测领域的一项重要创新手段。算法辅助的处理功能可以自动识别目标区域并提取信号，有效减少环境光线干扰和操作者主观因素的影响。在比色分析中，通过分析灰度差值可以降低背景干扰；而在荧光分析中，利用RGB颜色值进行比率量化则能显著提高检测的可靠性。由于操作便捷且成本较低，基于图像的视觉检测技术已被广泛应用于环境监测、临床诊断以及食品安全检测等领域。

本研究开发了一种双模式纳米酶印迹拭子传感平台，可用于现场检测唾液和汗液中的两种糖尿病酮症酸中毒关键生物标志物——丙酮和β-羟基丁酸。该平台通过溶胶-凝胶法在拭子两端分别聚合分子印迹聚合物，以ZIF-67作为纳米酶，实现对这两种物质的特异性识别。借助毛细作用，目标物质会被分配到两个空间分离的检测区域，从而使双端结构的印迹拭子传感器能够同时实现比色检测和比率荧光检测。通过自动图像分析算法处理拭子图像，可同时识别上下两个检测区域的信号变化，从而快速、便捷地对这两种生物标志物进行定量分析。这一集成化平台为糖尿病酮症酸中毒生物标志物的快速、便捷、无创现场检测提供了一种有效方案。

内容片段

实验部分

有关ZIF-67、R-CDs、B-CDs的材料、仪器及制备流程，以及ZIF-67的催化和过氧化酶样活性相关信息，还有通过高效液相色谱法进行的验证结果，均详细记载在补充信息中。

拭子传感平台的构建

如方案1所示，为确保印迹材料能够在拭子表面稳定固定，首先对拭子进行氨基功能化处理，使纤维表面形成大量的-NH?基团。随后通过溶胶-凝胶法构建双通道纳米酶印迹拭子传感器，将R-CDs@ZIF-67@MIP和B-CDs@ZIF-67@MIP分别聚合在拭子的上下两端，形成两个空间分离的双通道检测区域。在溶胶-凝胶印迹过程中

结论

本研究开发了一种集成两种分子印迹材料的双通道拭子传感平台，可通过纳米酶实现唾液和汗液中糖尿病酮症酸中毒生物标志物丙酮和β-羟基丁酸的同时检测。通过结合比色和荧光信号输出，并借助算法辅助的智能手机图像分析技术，该平台能够利用简单的拭子载体快速实现目标分析物的可视化识别和精准检测，便于即时进行现场分析。

作者贡献说明

Yujin Ouyang：正式分析。Xuyun Liu：验证工作。Ao Ma：方法设计。Zhihui Liao：初稿撰写、概念构思。Qiuyu Wu：实验研究。Jianmei Wu：项目管理工作。Zhaoxia Yang：项目监督。Zhaohui Zhang：文章修订与编辑、资金筹措。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号22476063和22164010）、湖南省研究生科研创新项目（无资金支持，项目编号LXBZZ2024303）的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。