《Sensors and Actuators A: Physical》：CRISPR/Cas12a-mediated ‘one to many’ signal transformation enabling sensitive quantification of microcystin-LR and HPV-16/HPV-18 using pregnancy test strip as readout
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苏航|江洪新|施鹏飞|李佳琪|魏正正|刘立尚|陈金荣|张树生中国山东省肿瘤标志物检测技术重点实验室，临沂大学，临沂276005摘要本文展示了一种新型妊娠试纸的重新利用策略，可用于灵敏检测核酸和非核酸目标物。首先，制备了能够对十六烷基三甲基溴化铵敏感响应的负载hCG的CaCO?@h
苏航|江洪新|施鹏飞|李佳琪|魏正正|刘立尚|陈金荣|张树生
中国山东省肿瘤标志物检测技术重点实验室，临沂大学，临沂276005
摘要
本文展示了一种新型妊娠试纸的重新利用策略，可用于灵敏检测核酸和非核酸目标物。首先，制备了能够对十六烷基三甲基溴化铵敏感响应的负载hCG的CaCO?@hCG微胶囊，从而控制hCG的释放。然后，利用DNA与CTAB之间的疏水相互作用，将CaCO?@hCG中的hCG释放机制转化为与DNA相关的反应，这一机制可便于同时检测核酸和非核酸目标物。为进一步提升检测灵敏度，还采用了CRISPR/Cas12a技术将少量DNA扩增为大量CTAB，从而无需进行PCR反应。借助Cas12a的特异性切割能力，可有效去除磁珠上连接短单链DNA的长双链DNA，留下游离的CTAB来触发hCG的释放。由此构建的“一变多”（一次切割产生多个CTAB分子）CRISPR-PTS重新利用平台，通过检测非核酸物质MC-LR和核酸物质HPV-16/HPV-18得到了进一步验证。该平台对MC-LR的检测下限为0.028?μg·L?1（约0.028?nM），比世界卫生组织的标准低30倍；而对两种高危型HPV的检测灵敏度也与实验室里的qPCR检测相当。这项工作不仅提供了一种通用且有效的信号放大方案，还省去了传统CRISPR-PTS中所需的hCG结合及DNA预扩增步骤，在环境监测和疾病筛查领域具有广阔的应用前景。
引言
即时检测技术在疾病预防、食品安全控制以及环境监测方面具有极高的实用性，尤其是在资源匮乏的地区[1]。然而，即便拥有出色的创意，要使即时检测设备实现商业化往往需要很长时间；因此，重新利用现有即时检测设备的策略受到了广泛关注[2]、[3]。妊娠试纸因其简单、低成本、便携且易于使用等优点，成为重新利用的理想候选者。若要使其功能不仅仅局限于检测怀孕，就需要将目标物的识别转化为人绒毛膜促性腺激素的释放[2]。在近期研究中，人们广泛使用了共价结合的DNA-hCG报告系统，这类报告系统通常被固定在磁珠、DNA组装体或氧化石墨烯片等载体表面，能够在目标物存在时释放DNA-hCG报告物[4]、[5]。不过，复杂的共价结合方式以及非特异性的报告物释放问题容易导致假阳性结果，这些问题亟待改进[4]。人们期望能开发出更稳定的hCG载体，以提高hCG加载的稳定性并简化相关流程[6]。在本研究中，我们制备了微观级别的物理负载型hCG载体——CaCO?@hCG胶囊，该载体在受到刺激时能够稳定且灵敏地释放hCG，从而在需要时为hCG信号提供有效的输出。
此外，妊娠试纸的检测灵敏度相对较低，仅适用于半定量分析，因此需要引入信号放大技术，比如CRISPR/Cas系统和核酸扩增技术[7]。由于Cas12a具备同时实现信号转导和信号放大的优势，多种CRISPR/Cas12a-PTS方案已被提出并开发出来[8]、[9]。通常情况下，Cas12a酶在特定目标序列存在时会被激活，进而高效地表现出针对单链DNA的非特异性内切酶活性，随后导致报告物被切割，hCG分子释放，最终产生信号。不过，大多数CRISPR-PTS检测工具仍依赖于DNA预扩增，因为每个报告物被切割后，激活的Cas12a只能产生一个信号分子[10]、[11]。目前的解决方案主要集中在如何大幅提升CRISPR/Cas12a系统的酶活性上，但这种方法难以取得进一步突破，且并不适用于所有类型的靶标DNA。唐本忠团队设计了一种特殊的AIEgen负载型双链DNA探针，该探针两端连接单链DNA，用于连接荧光团和淬灭剂，而非简单的单链DNA报告物，其灵敏度相比传统的FQ报告物提升了近80倍[12]。他们的研究启发我们，无需调整CRISPR/Cas12a系统的组成，而是设计独特的Cas12a切割底物来增强信号输出。另外，虽然适配体在CRISPR-PTS中的应用已将检测目标从核酸扩展到非核酸，但目前仍缺乏适用于不同类型生物分子和生物代谢物的信号放大策略[13]。
本文设计了一种“一变多”的信号放大策略。如图1所示，激活后的Cas12a蛋白会特异性切割连接双链DNA与磁珠的单链DNA连接器。得益于Cas12a对双链DNA和单链DNA的区分能力，被切割下来的双链DNA不会再次被切割。这样一来，Cas12a的跨切割活性就不会因反应产物的反复降解而被浪费。长双链DNA被去除后，磁珠就无法有效捕获和固定大量的游离CTAB分子，于是CTAB便作为启动剂，促使CaCO?载体持续释放hCG信号报告物。最终，通过系统地整合上述各个功能模块，成功构建了一个集成的“一变多”CRISPR-PTS检测平台。
微囊藻毒素-LR是一种由蓝藻产生的稳定性高、毒性强的肝脏毒素，它会对环境健康造成严重威胁，还会破坏水生生态系统[14]。对于人类而言，急性接触该毒素可能导致恶心、腹泻，甚至急性肝衰竭；长期接触则可能因摄入受微囊藻毒素污染的水或海鲜而增加患肿瘤和肝癌的风险[15]、[16]。鉴于其极高的毒性，世界卫生组织规定饮用水中的微囊藻毒素残留量应低于1.0?μg·L?1[17]。人乳头瘤病毒是一种极为常见的病毒，已知有200多种类型，根据其致癌风险可分为低风险型和高风险型[18]。其中，HPV-16和HPV-18这两种病毒就导致了全球约70%的宫颈癌病例，以及大量其他与HPV相关的癌症病例[19]、[20]。由于HPV-16/HPV-18感染与宫颈癌之间存在密切关联，相关检测已成为女性健康管理的重要组成部分[21]。由于微囊藻毒素和HPV-16/HPV-18在水质监测和女性健康管理中具有重要意义，因此本研究通过以它们分别作为非核酸目标物和核酸目标物，验证了“一变多”CRISPR-PTS平台的实用性。
章节节选
材料
无水氯化钙（分析级，纯度96%）、无水碳酸钠（纯度≥99.5%）、N-羟基琥珀酰亚胺（分析级，纯度99%）、Tris碱（分析级，纯度≥99.5%）、N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐（分析级，纯度98%）以及MES缓冲液（浓度0.5?M，pH值8.5）均购自上海麦克林生化科技有限公司。1×磷酸盐缓冲液（浓度0.01?M，pH值7.2–7.4）、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵以及十八烷基三甲基溴化铵
“一变多”CRISPR-PTS的原理
“一变多”CRISPR-PTS系统由适配体/激活剂复合物、Cas12a/crRNA、MB@dsDNA（短单链DNA连接磁珠与双链DNA，同时也作为Cas12a的跨切割位点）以及CaCO?@hCG组成（见图1）。对于非核酸目标物，适配体会与目标物结合，进而释放激活剂，触发Cas12a的跨切割活性；而对于核酸目标物，则是双链DNA直接与Cas12a/crRNA结合，从而引发切割反应。激活后的Cas12a会切割连接单链DNA的链接器（MC-LR的链接器长度为15个核苷酸，HPV DNA的链接器长度为18个核苷酸），进而去除长双链DNA
结论
总体而言，“一变多”CRISPR-PTS展示了将妊娠试纸重新用于检测hCG之外的其他分子的巨大潜力，可作为一种通用检测平台。相较于以往报道的妊娠试纸重新利用策略，本研究在三个方面进行了改进。首先，我们成功制备出了能够实现宽范围定量hCG释放且在干燥储存状态下不会发生非特异性泄漏的响应型CaCO?@hCG载体，从而避免了复杂、昂贵且需1:1比例共价结合的传统方法。其次，该策略的灵敏度提升了5000倍
CRediT作者贡献说明
李佳琪：实验验证、正式分析、数据整理。施鹏飞：实验验证、研究指导、资金获取。江洪新：论文初稿撰写、实验验证、数据整理、概念构思。苏航：论文初稿撰写、实验验证、正式分析、概念构思。张树生：论文审阅与编辑、研究指导、资源提供、资金获取。陈金荣：论文审阅与编辑、结果可视化、实验验证、正式分析、数据整理。刘立尚：论文撰写——
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了以下项目的支持：中国国家自然科学基金（项目编号：81502585、21675076、22576090）、山东省重点研发计划（项目编号：2025CXPT112）、山东省自然科学基金（项目编号：ZR2023MB139）以及中国大学生创新创业训练计划（项目编号：202410452015）。
补充材料
补充材料可免费获取，内容包括：CaCO?@hCG的特性分析、CaCO?的电子显微镜和激光共聚焦显微镜图像
