无细胞DNA甲基化检测技术的创新进展与临床应用

《Talanta》：Innovative Advances and Clinical Applications of Cell-Free DNA Methylation Detection Technologies

　　

Zhenhao Zhang|Luyao Zhu|Yiqian Ren|Jian Zhou|Yuxuan Dai|Wei Ren|Xingchun Gou

中国西安710021，西安医学院基础与转化医学研究所及陕西省脑疾病重点实验室

摘要

DNA甲基化检测技术的进步推动了与疾病相关的游离DNA分析的发展。游离DNA甲基化分析有望成为早期疾病诊断的有效临床工具。然而，目前的检测技术存在成本高、操作复杂以及对于低含量样本的灵敏度不足等问题。此外，其临床价值的最终验证仍需高质量研究提供的有力证据。因此，本综述首先梳理了游离DNA甲基化的历史发展脉络，接着比较了传统的检测方法以及最新的突破性技术。具体而言，本文系统分析了两种主要策略：基于亚硫酸盐处理的DNA修饰方法以及无需亚硫酸盐的处理方法，包括全基因组甲基化分析技术和针对特定基因组区域的技术。另外，为了评估这些方法的临床应用潜力，本文还详细介绍了相关技术的特点，如样本要求及在临床样本检测中的准确度。未来，游离DNA甲基化检测的发展将聚焦于临床应用，将技术创新与高效临床诊断的需求相结合。我们相信，本综述能够帮助研究人员选择适合样本情况与临床需求的检测方法。

引言

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，指甲基团附着在胞嘧啶的第五个碳原子上形成5mC [1]、[2]。这一过程包括建立、维持和去除三个阶段。具体来说，DNMT3a/3b酶会在重复序列、印记位点及调控元件中的胞嘧啶上添加甲基团，从而推动5mC的形成。而DNMT1酶则在DNA复制过程中复制甲基化模式，进而维持DNA甲基化状态[3]、[4]、[5]。5mC的去除则通过TET酶介导的氧化作用实现，该过程会将5mC转化为5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶[6]、[7]。在生物过程中，DNA甲基化的建立与维持对胚胎发育、转录调控、印记现象、X染色体失活以及染色质结构形成等均至关重要[8]，而这些变化可在组织、器官和血液中检测到，因此甲基化可作为早期诊断的敏感生物标志物[9]、[10]、[11]。由此可见，甲基化能够反映疾病的早期变化，有助于判断组织的来源[12]、[13]、[14]。例如，游离DNA的浓度和片段大小对生理和病理状态极为敏感，包括妊娠[15]、炎症[16]以及癌症[17]、[18]、[19]、[20]等情况。因此，甲基化分析对人类健康具有重要意义。

目前，甲基化分析大多依赖于侵入性的组织活检，尽管这种方法是疾病诊断的金标准，但其局限性（如样本差异大、获取难度高）与精准医疗的需求不相符[21]。在疾病早期，与疾病相关的生物标志物仅以微量存在，且大多数疾病一旦发病就会迅速发展。传统的检测方法需要大量样本、复杂的设备以及专业的操作人员，而且流程繁琐耗时，无法实现快速诊断。正如在即时检测和微型化多参数生物传感平台方面的研究所示，临床应用更需要微创取样、低样本量要求，以及能够实现准确、快速、即时检测和多参数定量分析的技术[22]、[23]。液体活检通过分析来自血液、尿液或脑脊液的游离DNA来应对这一挑战[24]、[25]。然而，在实际的临床生物流体样本中，超过90%的游离DNA来自血细胞，这会掩盖罕见的疾病特异性信号[26]，同时非特异性的游离DNA也会干扰目标序列的检测。此外，游离DNA的甲基化程度较低，且在血液循环中的半衰期较短，这些都可能带来假阴性结果的风险。最为关键的是，未甲基化的胞嘧啶及其氧化衍生物会干扰5mC的检测[27]、[28]。因此，迫切需要进一步优化现有的检测技术，并开发新的方法用于检测游离DNA的甲基化标志物。

在本综述中，我们全面探讨了游离DNA甲基化检测方法的分析性能，包括基于亚硫酸盐处理的方法和无需亚硫酸盐处理的方法，同时分析了其在临床应用中取得的进展与面临的挑战（见图1）。近年来，已有大量关于游离DNA甲基化检测的研究论文发表[29]。与以往该领域的综述相比，本综述具有多项创新之处。首先，它系统地整合了传统的基于亚硫酸盐的处理方法以及新开发的无需亚硫酸盐的处理方法，为各种主流检测技术提供了全面的概述。其次，我们深入分析了每种技术的分析原理、性能以及实际临床应用情况。通过分析临床样本，我们进一步总结了各种方法的优点与局限性，明确了它们各自的适用临床场景。本文对这些内容进行了深入分析并进行了差异化讨论。此外，我们还补充了对比表格和详细的示意图，以提高可读性和实用指导价值。总体而言，本文为研究人员和临床工作者提供了更为全面、更具应用导向的总结。

章节要点

用于临床游离DNA甲基化检测的基于亚硫酸盐处理的方法

基于亚硫酸盐的处理方法为甲基化的定性和定量分析提供了一种高效、快速且可重复的解决方案。其基本原理是，未甲基化的胞嘧啶通过亚硫酸盐处理转化为尿嘧啶，随后在测序过程中被识别为胸腺嘧啶，而5mC则保持不变，这样就可以通过不同方式区分胞嘧啶和5mC[30]。

基于这一原理，出现了多种基于亚硫酸盐处理的检测方法

用于游离DNA甲基化检测的无需亚硫酸盐处理的方法：临床转化中的创新与挑战

为了避免在亚硫酸盐处理过程中导致DNA丢失，人们开发出了无需亚硫酸盐的更温和的游离DNA检测方法。表2列出了当前主要的无需亚硫酸盐处理方法的性能、初始样本量要求以及应用场景。

基于CRISPR-Cas的新型游离DNA甲基化检测平台

前几节总结了基于亚硫酸盐处理和无需亚硫酸盐处理的预处理方法的原理、性能及临床应用。不过，要准确识别甲基化的CpG位点，还需要具备强大的信号识别和定量检测功能。CRISPR-Cas技术凭借精确的靶向能力和强大的信号放大效应，已成为一种先进的甲基化分析检测平台，目前已有许多相关的诊断检测方法被开发出来[96]、[97]。结合核酸技术

结论

游离DNA甲基化分析已经从基础研究发展到了临床转化的关键阶段。基于亚硫酸盐处理的方法拥有较为成熟的临床应用体系。基于亚硫酸盐处理的测序技术是实现准确诊断的可靠工具，微阵列技术则适用于高通量的群体筛查。MSP技术现已发展为商业化的检测试剂盒，也有经过临床批准的游离DNA甲基化检测方法。由于其优势，该技术已被广泛用于常规临床诊断中

CRediT作者贡献声明

Zhenhao Zhang：撰写——初稿撰写，资金获取，概念构思。Yiqian Ren：软件开发，资金获取。Luyao Zhu：撰写——初稿撰写。Yuxuan Dai：方法设计，资金获取。Jian Zhou：撰写——初稿撰写。Xingchun Gou：撰写——审稿与编辑，方法设计，资金获取。Wei Ren：撰写——审稿与编辑，实验研究

利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了学校工程研究中心的工程项目支持，该项目由陕西省教育厅资助（编号：25JR153），同时还获得了渭阳科技局项目（编号：202220）、西安市卫生健康委员会的相关项目支持（编号：2025qn13），以及陕西省自然科学基础研究计划的资助（编号：2024-JC-YBMS-726、2025JC-YBMS-117），还有陕西省科技创新基地-开放共享平台资源项目（编号：2024CX-GXPT-08）和大学生相关项目的支持