瓦瑞斯普拉迪布与珊瑚蛇抗毒血清对亚马逊珊瑚蛇（Micrurus spixii）毒液作用的效力比较

《Toxicon》：Comparison of the efficacy of varespladib and coral snake antivenom against the activities of the Amazon coral snake (Micrurus spixii) venom

　　纳塔莉亚·M·坎图阿里亚|费尔南达·R·帕索斯|卡罗琳·塞里诺-席尔瓦|玛丽莎·M·T·达罗沙|贝内迪托·卡洛斯·普雷佐托|斯蒂芬·海斯洛普|拉斐尔·S·弗洛里亚诺|马修·刘易恩|何塞·马里亚·古铁雷斯|吉奥科·奥希马-弗兰科巴西圣保罗州索罗卡巴市索罗卡巴大学摘要本研究评估了磷脂酶A2抑制剂瓦瑞斯普拉迪布对亚马逊珊瑚蛇毒液多种作用的抑制效果。将瓦瑞斯普拉迪布的中和作用与珊瑚蛇抗毒血清以及在新研究中使用的新斯的明进行了比较。该毒液在人血浆中具有抗凝活性（通过体外血栓弹性测定法检测），还会导致肌毒性（表现为血清肌酸激酶活性上升）、对小鼠具有致死性，同时在分离的小鸡颈背肌标本中会引起神经肌肉阻断。抗毒血清能完全防止死亡，但在测试剂量下仅能部分中和其他毒性作用。瓦瑞斯普拉迪布可减轻由磷脂酶A2介导的抗凝活性和肌毒性，但无法消除致死性。瓦瑞斯普拉迪布与抗毒血清联合使用则对抗凝活性和肌毒性更有效。两者单独使用对抑制毒液引起的神经肌肉阻断作用效果有限，表明可能还有其他毒素参与其中。抗毒血清与瓦瑞斯普拉迪布联合使用的抑制效果优于二者单独使用，对抗凝、肌毒性和神经肌肉阻断作用均有更好效果。抗胆碱酯酶药物新斯明仅能轻微缓解致死性和神经肌肉阻断症状。这些研究结果表明，瓦瑞斯普拉迪布有望作为传统抗毒血清疗法的辅助手段，用于治疗亚马逊珊瑚蛇咬伤。引言珊瑚蛇属于Micrurus属，广泛分布于美洲，其分布范围从美国东南部延伸到阿根廷北部（Campbell和Lamar，2004；Silva Jr.等人，2021a）。尽管在整个分布区域内，珊瑚蛇造成的咬伤占比不足2%，但由于其毒液具有强效的神经毒性，这类咬伤仍可能非常危险（Otero-Pati?o，2014；Bucaretchi等人，2016、2021；巴西卫生部，2019；Risk等人，2021）。这种周围神经毒性是由两类主要毒素介导的突触前和突触后作用共同导致的：一类是三指毒素家族的α神经毒素，它们能与突触后烟碱型乙酰胆碱受体结合；另一类是磷脂酶A2β神经毒素，它们会作用于神经末梢膜，干扰乙酰胆碱的释放（Aird和Silva Jr.，2021；Baudou等人，2021；Floriano等人，2021）。不同Micrurus属物种的毒液中，这两类毒素的比例各不相同（Lomonte等人，2016、2021；Sanz等人，2019b）。除神经毒性外，Micrurus属毒液还会在实验动物身上引发肌毒性、炎症、凝血功能障碍和肾脏损伤（Salazar等人，2011、2018；de Roodt等人，2013；Casais-e-Silva等人，2016；Oliveira等人，2017；Dashevsky等人，2021；Gutiérrez等人，2021；Silva-Carvalho等人，2022a、b），不过这类作用在人类咬伤中的重要性尚不明确（Otero-Pati?o，2014；da Silva等人，2019；Bisneto等人，2020；Bucaretchi等人，2021）。人类被珊瑚蛇咬伤后会出现周围神经毒性症状，如感觉异常，以及肌肉无力、视力模糊、神经肌肉阻断进而导致弛缓性瘫痪，严重时还会出现呼吸停止甚至死亡（Otero-Pati?o，2014；Bucaretchi等人，2016、2021；Risk等人，2021）。治疗咬伤的标准方法是使用珊瑚蛇抗毒血清（de Roodt等人，2013、2021；Otero-Pati?o，2014；Dolab等人，2014；Bucaretchi等人，2021；Ho等人，2021；Vélez等人，2024）。在巴西，这种抗毒血清由布坦坦研究所（圣保罗）和埃塞基尔·迪亚斯基金会（FUNED，米纳斯吉拉斯州贝洛奥里藏特）生产，所用血清来自被混合了Micrurus frontalis和Micrurus corallinus毒液的物质进行超免疫处理的马匹，根据制造商的标准，1毫升抗毒血清可中和1.5毫克的M. frontalis参考毒液（Bucaretchi等人，2021；Ho等人，2021）。这种抗毒血清通常在医院中使用，有时会搭配抗胆碱酯酶药物如新斯明，以更好地解除呼吸系统神经肌肉阻断，严重病例还需配合机械通气支持（Vital Brazil和Vieira，1996；Bucaretchi等人，2016、2021）。虽然珊瑚蛇抗毒血清在临床应用中效果显著，但由于不同Micrurus属物种的毒液成分和免疫学特性存在差异，其中和效果也会有所不同（Higashi等人，1995；de Roodt等人，2004、2021；Moraes等人，2003；Abreu等人，2008；Tanaka等人，2010、2016）。巴西境内至少有35种Micrurus属物种（Silva Jr.等人，2021a、b），它们的临床危害程度各异（Bucaretchi等人，2021；Buononato等人，2021），而目前使用的珊瑚蛇抗毒血清仅针对其中两种物种的毒液制备，因此有必要探索能够补充抗毒血清、并在咬伤后快速使用的替代方案。近十年来，磷脂酶A2抑制剂瓦瑞斯普拉迪布被视为一種具有潜在应用价值的化合物，可用于作为初步野外处理手段或蛇咬伤抗毒血清的辅助药物（Lewin等人，2016、2022；Gutiérrez等人，2020、2025；Koh等人，2020；Hamza等人，2021；Sampat等人，2023）。大量研究表明，瓦瑞斯普拉迪布能够抑制多种蛇类毒液中的磷脂酶A2活性，从而避免该酶带来的有害影响（Lewin等人，2016；2018a、b；Wang等人，2018；Xiao等人，2018；Bryan-Quirós等人，2019；Salvador等人，2019、2021；Oliveira等人，2020；Zinenko等人，2020；Gutiérrez等人，2021；Gutierres等人，2022；Souza等人，2022；Couceiro等人，2023；Bartlett等人，2024；Chowdhury等人，2024；Murphy等人，2024；Zhao等人，2024；Rudresha等人，2025；Solano等人，2025；Yong等人，2025）。将瓦瑞斯普拉迪布作为治疗蛇咬伤的辅助成分，相比传统抗毒血清具有诸多优势，比如运输和储存更为便捷，该抑制剂无需在恒温环境下保存，也便于在野外使用。亚马逊珊瑚蛇是体型最大的珊瑚蛇物种之一（部分个体的全长超过1.8米），分布于巴西亚马逊地区的大部分地区以及周边一些国家（哥伦比亚东部、委内瑞拉西南部、玻利维亚东部和巴拉圭东北部）（Nascimento等人，2019；Silva Jr.等人，2021b）。转录组分析（Aird等人，2017；Aird和Silva Jr.，2021）和蛋白质组分析（Sanz等人，2019a）显示，M. spixii的毒液主要由三指毒素和磷脂酶A2组成，不过其中也含有少量其他蛋白质，如L-氨基酸氧化酶、C型凝集素和金属蛋白酶。酶学检测表明，M. spixii毒液中含有不同水平的乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸单酯酶、L-氨基酸氧化酶、透明质酸酶、亮氨酸氨基肽酶和磷脂酶A2活性，但几乎不存在蛋白水解活性（Aird和Silva Jr.，1991；Barros等人，1994；Tambourgi等人，1994；Tanaka等人，2010；Terra等人，2015），不过也有研究报道该毒液对荧光共振能量转移蛋白水解底物Abz-FEPFRQ-EDnp具有活性（Tanaka等人，2010）。在M. spixii毒液中始终可以检测到磷脂酶A2活性（Vital Brazil等人，1995；Tanaka等人，2010；Couceiro等人，2023），这一结果与蛋白质组分析中关于该毒液含有的这种酶的数据一致（Sanz等人，2019a）。除了神经毒性外，该毒液在实验动物身上还会引发水肿、肌毒性和溶血反应，几乎没有或完全没有抗凝活性，也不具备出血性作用（Gutiérrez等人，1992；Barros等人，1994；Tambourgi等人，1994；Terra等人，2015）。Vital Brazil等人（1995）通过体外大鼠膈神经-膈肌和雏鸡颈背肌标本，研究了M. spixii毒液的实验性神经毒性。该毒液在两种标本中都会引起神经肌肉阻断，而在大鼠膈神经-膈肌标本中，通过清洗或添加新斯明只能部分逆转这种阻断作用。该毒液对直接肌肉刺激引发的肌肉抽搐反应影响很小或没有影响，但对卡巴胆碱（作用于大鼠膈肌）和乙酰胆碱（作用于大鼠慢性去神经化的半膈肌及雏鸡颈背肌标本）引发的反应则会完全消失。该毒液不会影响大鼠膈肌的静息膜电位，但最初会刺激微小终板电位，随后又会使其消失。基于这些研究结果，作者认为该毒液主要是通过突触后作用（可能是通过对烟碱型乙酰胆碱受体的变构调节）引发阻断，但也存在一定程度的突触前作用。后续研究也在小鼠膈神经-膈肌和雏鸡颈背肌标本中证实了该毒液的神经肌肉活性，而且从该毒液中还分离出一种名为MsPLA2-I的磷脂酶A2，它能在小鼠膈神经-膈肌标本中引发不可逆的神经肌肉阻断和肌肉损伤（Terra等人，2015）。鉴于M. spixii毒液含有较高的磷脂酶A2活性，且瓦瑞斯普拉迪布能够保护并有时逆转蛇毒磷脂酶A2的作用，本研究探讨了瓦瑞斯普拉迪布能否减轻该毒液在小鼠体内的抗凝活性、肌毒性和致死性，以及能否在体外雏鸡颈背肌标本中对抗神经肌肉阻断作用。我们将这种效果与珊瑚蛇抗毒血清的效果进行了比较，同时也分析了瓦瑞斯普拉迪布与抗毒血清联合使用的潜在优势。本研究结果表明，瓦瑞斯普拉迪布有望作为抗毒血清的辅助药物，用于治疗亚马逊珊瑚蛇咬伤。毒液与抗毒血清冻干后的M. spixii毒液（批号01/15-01）由巴西圣保罗州布坦坦研究所的爬虫学实验室提供。在体外和体内实验中，该毒液被溶解在无菌的0.9%氯化钠溶液中；而在离体实验中，则被溶解在克雷布斯溶液中（成分见2.10节）。珊瑚蛇抗毒血清[AV；批号090310-03A，产自巴西米纳斯吉拉斯州埃塞基尔·迪亚斯基金会，有效期至2013年3月，蛋白质浓度为83.7毫克/毫升]。磷脂酶A2活性无论是珊瑚蛇抗毒血清还是瓦瑞斯普拉迪布都能抑制M. spixii毒液中的磷脂酶A2活性，不过瓦瑞斯普拉迪布的抑制效果更强。当使用26微升的珊瑚蛇抗毒血清处理10微克的毒液时，可观察到剂量依赖性的抑制效应，最大抑制率约为43±1.6%。而瓦瑞斯普拉迪布则能完全抑制磷脂酶A2活性，说明其在消除这种酶活性方面的效果远优于单独使用珊瑚蛇抗毒血清（见图1）。抗凝活性未加入毒液的人血浆的凝血时间（对照值）为822±48秒（n=6）。讨论磷脂酶A2抑制剂瓦瑞斯普拉迪布因其能有效抑制毒液中的磷脂酶A2带来的有害作用，成为治疗蛇咬伤的理想候选药物（Lewin等人，2016、2022；Gutiérrez等人，2021、2025），包括由磷脂酶A2介导的神经毒性（Lewin等人，2018a、b；Gutiérrez等人，2020；Oliveira等人，2020；Silva-Carvalho等人，2022a；Tan等人，2022；Gilliam等人，2023；Lay等人，2023；Lay和Hodgson，2024a、b；Woliver等人，2025）。由于M. spixii毒液的组成……结论本研究表明，瓦瑞斯普拉迪布对M. spixii毒液的抗凝活性、神经毒性、肌毒性和致死性具有不同的影响作用。抗凝活性和肌毒性是由磷脂酶A2介导的，因为这两种活性都能被瓦瑞斯普拉迪布有效抑制，而珊瑚蛇抗毒血清与瓦瑞斯普拉迪布联合使用则能提供更高的保护效果。相比之下，神经肌肉阻断似乎是α神经毒素和磷脂酶A2共同作用的结果，因为瓦瑞斯普拉迪布和新斯明只能部分起到保护作用。作者贡献声明吉奥科·奥希马-弗兰科：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，正式分析，概念构建。纳塔莉亚·M·坎图阿里亚：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，方法学，研究实施，概念构建。费尔南达·R·帕索斯：方法学，研究实施。斯蒂芬·海斯洛普：写作——审稿与编辑，正式分析。拉斐尔·S·弗洛里亚诺：写作——审稿与编辑，正式分析。马修·刘易恩：写作——审稿与编辑，正式分析。何塞·马里亚·古铁雷斯：写作——未引用参考文献巴西卫生部，2019；Knudsen等人，2020。伦理声明本研究实验方案已获得布坦坦研究所实验动物护理与使用委员会（方案编号1807290922）和索罗卡巴大学（方案编号229/2022）的批准。人类血浆的使用已获得研究伦理委员会（CEP）/国家研究伦理委员会（CONEP）的批准（批准编号CAAE 43560620.0.0000.5493）。利益冲突声明作者声明不存在可能影响本文所述工作的任何财务利益或个人关系。数据可用性所有相关数据均已包含在本报告中，如需获取可提出合理请求。伦理声明实验方案已获得布坦坦研究所实验动物护理与使用机构委员会（方案编号1807290922）以及索罗卡巴大学（方案编号229/2022）的批准。手稿准备过程中生成式AI及AI辅助技术的使用声明在撰写本文档时，作者使用了ChatGPT和Grammarly来辅助英语写作。科学内容、观点及结论完全由作者负责。在使用这些工具后，作者对手稿进行了仔细审阅和编辑，并对其内容承担全部责任。利益冲突声明? 作者声明不存在任何可能影响本文所述工作的已知财务利益或个人关系。致谢作者感谢布坦坦研究所提供的基础设施，以及两栖爬行动物学实验室和药理学实验室在实验期间的支持。本研究还得到了圣保罗州研究资助基金会（FAPESP，项目编号2004/09705-8、2007/53883-6和2008/50669-6）的资助。NMC由高等教育人员培训协调委员会（CAPES，项目编号88887.710898/2022-00）提供支持。FRP则由机构奖学金计划资助。