《Virology》：Identification of three novel overlapping epitopes within the immunodominant region of ASFV p30 protein facilitates development of a competitive ELISA for antibody detection
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Xuesai Li|Qingli Niu|Jinming Wang|Xiaoyu Zou|Hualin Sun|Hong Yin|Siyuan Dou|Guiquan Guan|Jifei Yang中国农业农村科学院兰州兽医研究所非洲猪瘟专业实验室，动物疫病控制与预防国家重点实验
Xuesai Li|Qingli Niu|Jinming Wang|Xiaoyu Zou|Hualin Sun|Hong Yin|Siyuan Dou|Guiquan Guan|Jifei Yang
中国农业农村科学院兰州兽医研究所非洲猪瘟专业实验室，动物疫病控制与预防国家重点实验室，甘肃省兰州市徐家坪1号，邮编730046，中国
摘要
非洲猪瘟病毒会引发猪只的严重疾病。目前全球范围内该病毒仍在肆虐，其主要由II基因型毒株引起，而减毒突变株和基因型间重组毒株的出现更是让情况愈发复杂，因此亟需更先进的诊断工具以及对病毒抗原结构更深入的了解。病毒磷蛋白p30是感染早期就会表达的免疫优势抗原，非常适合用于诊断和疫苗研发。在本研究中，我们制备了三种针对p30的新单克隆抗体，分别命名为2A8（IgG2b，κ）、2B3（IgG2a，κ）和13A7（IgG1，κ），这些抗体在非洲猪瘟病毒感染的巨噬细胞中能与重组及天然形式的p30产生强烈反应。通过表位分析，我们在p30的免疫优势区域即氨基酸76–93之间发现了三个精确的线性重叠表位：76EHQAQEEWNM85（2A8）、83WNMILHVLFEE93（2B3）以及76EHQAQEEWNMILHVLF91（13A7），这些表位在I、II基因型以及I/II基因型重组毒株中都保持完全一致。竞争性结合试验表明，由于表位重叠，这些单克隆抗体之间存在相互抑制作用，其中13A7与典型的非洲猪瘟阳性猪血清的竞争能力最强。基于这一竞争抑制特性，我们开发出一种用于检测非洲猪瘟病毒的竞争性ELISA方法。该检测方法具有较高的分析灵敏度，且不会与其他主要猪源病毒的血清发生交叉反应。在检测344份实际样本时，其结果与市面上的基于p72单克隆抗体的竞争性ELISA试剂盒的符合度达97.38%（κ=0.941）。本研究确定了p30的氨基酸76–93区域是极具抗原性的区域，为非洲猪瘟病毒抗体的检测提供了可靠的方法，有助于在日益复杂的疫情形势下更好地开展监测与防控工作。
引言
非洲猪瘟是一种严重的、高度传染性的病毒性出血性疾病，可感染各种品种和年龄的家猪及野猪，其病原为非洲猪瘟病毒（Dixon等，2020；Schulz等，2019）。自1921年在肯尼亚首次被发现以来，非洲猪瘟已从非洲地区扩散到欧洲、亚洲和美洲，成为威胁全球养猪业持续存在的危险因素，给世界各地带来了严重的经济社会影响（Gonzales等，2021；Rowlands等，2008；Zhou等，2018）。尽管多年来人们一直在努力研究非洲猪瘟病毒的生物学特性、宿主免疫反应以及病毒的致病机制，但目前仍没有安全有效的商业疫苗可用于预防非洲猪瘟（Gallardo等，2019a）。虽然用减毒活病毒免疫猪只后能观察到其对同源病毒的部分防护作用，但由于存在安全性、残留毒力以及可能恢复致病性等方面的问题，这类疫苗尚未获得批准并广泛使用（Sanchez-Vizcaino等，2015）。由于缺乏有效的抗病毒药物，非洲猪瘟的防控工作更加困难，因此需要依靠早期精准检测、严格的流动限制、加强生物安全措施以及全面的监测体系，尤其是在尚未出现非洲猪瘟的地区（Gallardo等，2019a）。
非洲猪瘟病毒是目前已知危害猪只的最致命病毒之一，某些高毒力毒株甚至能导致100%的死亡率（Sanchez-Vizcaino等，2015）。作为Asfarviridae科、Asfivirus属的唯一成员，非洲猪瘟病毒是一种大型、有包膜的双链DNA虫媒病毒，其传播媒介为Ornithodoros属的软蜱（Dixon等，2020；Gaudreault等，2020）。该病毒的基因组长度在170到193千碱基对之间，可编码大约150到167个开放阅读框，这些阅读框对应着68种结构蛋白以及许多参与病毒复制、逃避免疫反应和致病过程的非结构蛋白（Dixon等，2019）。根据B646L基因C端序列的差异，非洲猪瘟病毒被分为24种不同的基因型，这反映出当前流行的病毒株之间存在较大的遗传多样性（Achenbach等，2017）。到了20世纪90年代中期，除了意大利的撒丁岛外，非洲以外的地区已经消除了I基因型的非洲猪瘟病毒（Mur等，2016），但此后该疾病又在2007年出现在格鲁吉亚，随后于2014年传播到欧盟，2018年传入亚洲的中国，2021年传入美洲的多米尼加共和国（Dixon等，2020；Zhou等，2018）。目前在这些非洲以外地区流行的病毒属于高毒力的II基因型p72毒株，与2007年在格鲁吉亚发现的病毒株极为相似（Ge等，2018；Li等，2025；Zhao等，2023a）。不过，最近的研究发现，在欧洲的野猪以及中国的家猪中出现了毒力较低的非洲猪瘟病毒II基因型自然突变株（Gallardo等，2019b；Nurmoja等，2017；Sun等，2021b）。这类减毒毒株只会引发亚急性或慢性病症，因此比高毒力毒株更为隐蔽（Sun等，2021b）。除了在撒丁岛存在低毒力I基因型毒株外，中国也出现了这类毒株，它们会导致轻度的感染症状和慢性疾病（Sun等，2021a）。这类低毒力毒株的隐秘传播可能会使其在广阔的地域范围内未被察觉地扩散（Gallardo等，2019b；Sun等，2021b）。此外，中国、越南和俄罗斯的家猪中也发现了I基因型和II基因型的重组非洲猪瘟病毒株，而且这些重组毒株也被认定为高毒力毒株，给当前的非洲猪瘟防控工作带来了巨大挑战（Igolkin等，2024；Le等，2024；Zhao等，2023a）。
非洲猪瘟病毒编码多种结构蛋白和非结构蛋白，其中主要的结构磷蛋白p30是其最具免疫原性的抗原之一。这种蛋白在病毒复制周期的早期就会大量表达，因此可作为可靠的生物标志物用于诊断（Jancovich等，2018）。p30还在病毒入侵过程中起着关键作用，它有助于非洲猪瘟病毒进入宿主细胞，同时也有助于病毒的组装和形态形成（Gomez-Puertas等，1998；Hernaez等，2008）。鉴于p30的早期表达特性、功能重要性以及强大的抗原性，它不仅可作为重要的诊断抗原，还可用于亚单位疫苗的研发以及研究非洲猪瘟病毒与宿主之间的相互作用。针对p30蛋白的特异性抗体，以及在该病毒结构蛋白中发现的高度保守的免疫优势表位，对于设计适用于不同非洲猪瘟病毒基因型的诊断工具、指导亚单位疫苗的开发以及阐明病毒入侵机制都具有至关重要的作用。
在本研究中，我们通过给BALB/c小鼠接种疫苗，成功制备出了针对非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体。通过系统的表位分析，我们在p30蛋白的免疫优势区域，即氨基酸76–93之间，找到了三个精确的、新的线性重叠表位。这些新发现的表位进一步丰富了人们对p30蛋白抗原特性的认识，也为开发更高效的非洲猪瘟病毒抗体检测竞争性ELISA方法奠定了基础。值得注意的是，针对这些重叠表位的抗p30单克隆抗体能够对p30抗原产生相互竞争的结合作用，这一特性对于开发竞争性ELISA方法极为有利，因为这样的表位识别能够让这些抗体与血清中的抗体在抗原结合位点上展开有效竞争，从而提升检测性能。
章节节选
细胞、病毒与样本
本研究所使用的细胞、病毒、样本及试剂的具体信息详见补充材料。
针对p30蛋白的单克隆抗体的制备
非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体是按照先前描述的方法制备的（Tesfagaber等，2024）。简而言之，我们给6周龄的雌性BALB/c小鼠皮下注射50微克的重组p30蛋白，该蛋白是与等体积的完全弗氏佐剂混合后的形式（Sigma-Aldrich，美国）。之后每隔两周再给予两次相同的抗原作为加强免疫。
针对非洲猪瘟病毒p30蛋白的特异性单克隆抗体的制备与鉴定
我们通过给BALB/c小鼠接种重组p30蛋白，再让这些小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，从而获得了针对非洲猪瘟病毒p30蛋白的特异性单克隆抗体。最终我们找到了三株能够分泌这类抗体的杂交瘤细胞系，分别命名为2A8、2B3和13A7。我们将这些杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内以诱导腹水生成，然后从腹水中提取出这些单克隆抗体（见图1A）。这三种单克隆抗体都能特异性地与重组p30结合，其滴度分别为1:128,000（2A8）、1:16,000（2B3）。
讨论
尽管自非洲猪瘟首次被记录以来已经过去了一个多世纪，但它依然对全球养猪业构成严重威胁，因为它会导致猪只的高死亡率，而且目前还没有可供使用的商业疫苗和有效的治疗手段（Dixon等，2020）。识别病毒特异性抗体以及全面绘制抗原表位图对于提升诊断的准确性、为疫苗设计提供依据以及辅助治疗工作都具有重要意义。
伦理声明
所有动物实验都是严格按照中华人民共和国的动物伦理操作规范进行的，并且已经得到了中国农业农村科学院兰州兽医研究所动物管理及伦理委员会的批准（批准编号为LVRIAEC-2024-095）。
资金支持
本研究的经费支持来自甘肃省自然科学基金重点计划（编号：24JRRA011）、中国的国家关键研发计划（编号：2024YFD1800104和2021YFD1800101）、中国农业农村科学院的创新计划（编号：CAAS-ASTIP-2021-LVRI）、创新研究群体科学基金（编号：22JR5RA024）、甘肃省的专项项目（编号：22CX8NA011）以及重大科技项目（编号：22ZD6NA001），还有中央政府的支持。
CRediT作者贡献说明
Xuesai Li：正式分析、研究工作、方法学研究、撰写初稿。Qingli Niu：正式分析、研究工作、撰写文章——负责审阅与编辑。Jinming Wang：研究工作、方法学研究、撰写文章——负责审阅与编辑。Xiaoyu Zou：正式分析、研究工作。Hualin Sun：正式分析、撰写文章——负责审阅与编辑。Hong Yin：方法学研究、撰写文章——负责审阅与编辑。Siyuan Dou：正式分析、研究工作。Guiquan Guan：方法学研究、撰写文章——负责审阅与编辑。Jifei Yang：
利益冲突声明
此处附上我们的论文，标题为“识别非洲猪瘟病毒p30蛋白免疫优势区域内的三个新的重叠表位，有助于开发用于抗体检测的竞争性ELISA方法”。
作者声明，我们不存在任何可能影响本文研究结果的财务或其他个人利益冲突。
感谢您对我们论文的认真审阅，我们期待收到审稿人的反馈意见。
