生物气驱动的侧流脱氮技术：以好氧甲烷氧化-反硝化替代部分亚硝酸化处理，实现碳中和的废水处理方案

《Water Research》：Biogas-driven sidestream nitrogen removal: A perspective on replacing partial nitritation with aerobic methane oxidation–denitrification toward carbon-neutral wastewater treatment

　　金一泰|郑允娜|李艺恩|安光浩|郑镇洪摘要厌氧消化产生的侧流废水虽仅占进水总量的不到5%，却带来了极高的氮负荷（通常占整个处理厂氮负荷的15–25%），给污水处理厂带来巨大负担。目前现有的生物去除技术，如部分亚硝酸化/厌氧氨氧化工艺以及基于厌氧甲烷氧化的工艺，与现场沼气利用系统之间缺乏关联。在本综述中，我们探讨了在两级集成系统中用兼性甲烷氧化与反硝化工艺替代传统部分亚硝酸化阶段的可行性，以实现碳中和的侧流氮去除目标。我们总结了关于甲烷氧化微生物群落、不同微生物群体间的碳转移机制，以及侧流废水成分和沼气中的二氧化碳在维持整体工艺性能中的作用等方面的现有研究。研究结果表明，兼性甲烷氧化与反硝化工艺可作为多功能上游处理阶段，同时提供亚硝酸盐、减少铵负荷，并为下游依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化菌群提供碳源，从而无需外部碳输入即可实现完全的氮去除。该工艺面临的主要挑战包括温室气体排放控制、高浓度侧流废水条件下的膜污染，以及微量营养素可用性的限制，这些都可能影响微生物的长期稳定性。本综述提出了兼性甲烷氧化与反硝化/依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化工艺设计的整合框架，指出了试点验证和多微生物群体工程方面的研究重点，并阐述了在城市水资源回收中实现循环生物经济的发展路径。1. 引言要在水务领域实现碳中和，就需要突破现有的沼气利用模式。在大多数污水处理厂中，厌氧消化产生的沼气被用于热电联产，产生的二氧化碳则直接排放到大气中。不过，通过去除二氧化碳来提升沼气品质的方法在典型处理规模下仍需大量投资且经济性较差（Batlle-Vilanova等人，2015年）。生物升级技术——即直接将沼气转化为高价值化合物——被认为是一种更为综合的替代方案，它既能利用甲烷，又能促进二氧化碳封存，还能产出有用产品（Kalyuzhnaya等人，2015年）。除了有效利用沼气外，污水处理厂另一个长期存在的难题是处理厌氧污泥脱水过程中产生的侧流废水。尽管这些废水在总进水中占比很小，但它们所含的氮负荷却很高，给主处理流程带来很大负担（Metcalf & Eddy，2014年）。在本文中，“侧流”指的是与主流处理流程并行运行的专用处理线路，而“侧流废水”则特指厌氧消化污泥脱水后产生的、富含铵的高浓度液体，这类液体正是进入侧流处理线路的原料。传统的氮去除方法，如好氧硝化-反硝化、氨气吹脱和鸟粪石结晶，都会带来较高的外部碳需求、能耗问题，还会留下残余氮污染（Fux等人，2002年；Kinidi等人，2018年；Iftikhar和Tao，2024年）。部分亚硝酸化/厌氧氨氧化工艺通过将选择性将铵转化为亚硝酸盐的工艺与厌氧氨氧化工艺相结合，大大降低了曝气能耗，实现了无需外部碳输入的自养氮去除。该工艺最初在两级系统中得到验证，此后已在全球范围内应用于实际规模的系统，过去二十年间也有大量相关研究（Siegrist等人，1998年；Lackner等人，2014年；Wang等人，2022年）。然而，这种工艺仍存在诸多局限性：首先，由于厌氧氨氧化细菌的倍增时间较长，导致启动速度较慢；其次，它在低温环境下（低于25摄氏度）容易失去活性；第三，对高浓度亚硝酸盐较为敏感；第四，会产生一定量的残余硝酸盐，通常需要通过外部碳源进一步处理才能达标（Jetten等人，2001年；Lackner等人，2014年；Fan等人，2023年；Dou等人，2025年）。此外，这种工艺与现场沼气利用系统之间缺乏关联，在传统系统中，侧流废水中的溶解甲烷往往会释放到大气中，从而加剧温室气体排放（Lu等人，2024年）。依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化工艺是一种很有前景的替代方案，它利用甲烷作为电子供体进行生物反硝化，从而解决了部分亚硝酸化/厌氧氨氧化工艺的两大缺陷。这一过程由两种代谢途径不同的微生物群体参与，我们在文中会分别对其进行说明：一类是亚硝酸盐依赖型厌氧甲烷氧化细菌，属于NC10门，例如Ca. Methylomirabilis oxyfera，这类细菌能够将甲烷氧化与亚硝酸盐还原相结合；另一类是硝酸盐依赖型厌氧甲烷氧化古菌，属于ANME-2d支系，例如Ca. Methanoperedens nitroreducens，这类细菌则能将硝酸盐还原为亚硝酸盐；只有在讨论整体工艺或这两种微生物群体共同作用时，才会使用“依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化”这一统称。这种工艺能够在不添加外部碳源的情况下，同时实现溶解甲烷的回收和完全的氮去除（Ettwig等人，2010年；Shi等人，2013年）。从气候角度而言，溶解甲烷若被释放到大气中，会带来严重的全球变暖效应：其100年的全球变暖潜力约为每千克甲烷27–30千克二氧化碳当量（IPCC AR6，2021年），因此，即使是在厌氧处理后的废水中残留的少量溶解甲烷，也会产生不容忽视的二氧化碳当量排放，而生物回收技术则可以避免这类排放。不过，要实际应用依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化工艺，仍然需要一个上游的部分亚硝酸化反应器，为下游的该类微生物群提供所需的亚硝酸盐。这个上游反应器虽然能实现好氧硝化功能，但它与沼气利用和碳回收系统之间仍缺乏关联，且会消耗曝气能量（Fan等人，2023年；Tentori等人，2024年）。这种依赖关系的存在，以及目前尚未出现能够同时提供亚硝酸盐、去除铵负荷并利用沼气中的碳元素的替代上游处理阶段，正是促使我们撰写这篇综述的原因。兼性甲烷氧化与反硝化工艺最早是由Modin等人（2008年）在膜生物膜反应器中作为概念性工艺提出的。此后，研究人员又研究了甲烷氧化菌向反硝化菌供应甲醇的机制、关键操作参数，以及提升氮去除效率的膜反应器设计方法（Zhu等人，2017年；Xu等人，2020年；Lu等人，2021年）。最近，人们开始探索在低氧条件下将好氧甲烷氧化与厌氧氨氧化结合的集成工艺（Xie等人，2023年），该工艺也已被直接应用于实际的厌氧消化液处理中（Tentori等人，2024年）。不过，大多数早期研究都使用的是合成水或稀释后的低浓度废水，而且没有研究同时考虑将实际污水处理厂产生的沼气——包括其中的二氧化碳成分——用于生物碳固定，同时实现高效的氮去除。此外，针对实际侧流废水条件下的三类微生物群体动态的研究也非常少。我们之前开展的一系列实验（Kim等人，2018–2021年）是唯一一项直接使用未经稀释的高浓度污水处理厂侧流废水，并结合实际污水处理厂产生的沼气进行处理的科研工作。我们在实验中鉴定出了由甲烷氧化菌、甲基嗜菌科细菌和伯克霍尔德氏菌群组成的三类微生物群体，同时证实了它们能够同时进行铵同化、反硝化作用以及生物二氧化碳固定。表1汇总了目前关于兼性甲烷氧化与反硝化工艺的主要研究情况。表1. 各项基于兼性甲烷氧化与反硝化工艺、利用好氧甲烷氧化菌实现氮去除的研究对比。年份处理目标废水中的铵氮含量（毫克/升）主要特点氮去除效果参考文献2008合成硝酸盐无首次在膜生物膜反应器中展示该工艺；通过中空纤维实现无气泡甲烷供应；建立了包含甲烷氧化菌和反硝化菌的两类微生物模型8–12毫克氮/升·天Modin等人，2008年2017年合成硝酸盐/亚硝酸盐约50–100，氧气与甲烷的比例为0.25体积比时该比例被认定为该工艺的最佳值；仅采用批次培养方式；未使用连续式膜生物膜反应器；未实现铵氮去除氮去除效果未进行量化（仅分析了批次培养的动力学数据，未提供连续流动状态下的数据）Zhu等人，2017年2020年合成硝酸盐约50，明确了甲醇跨供给的效率（38–60%的甲烷可转化为甲醇）；碳氮比为1.79，接近理论最低值；未实现铵氮去除22.09毫克氮/升·天Xu等人，2020年2021年合成硝酸盐约30–60，采用双层膜膜生物膜反应器；生物膜密度超过70克VSS/平方米；重点研究了膜反应器设计；未实现铵氮去除740毫克硝酸盐氮/平方米·天（即氮通量值）Lu等人，2021年2023年合成铵盐和硝酸盐共约100–200，在缺氧条件下将好氧甲烷氧化菌与厌氧氨氧化菌共同培养于多介质生物膜反应器中；未涉及依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化古菌；未利用沼气中的二氧化碳；铵氮含量为72毫克/升，硝酸盐含量为63毫克/升·天Xie等人，2023年2024年实际厌氧消化液，高浓度（含铵盐和甲烷），在单级膜生物膜反应器中结合实际厌氧消化液使用ME-SND工艺；通过调节氧气压力实现工艺优化；厌氧氨氧化菌数量较多，但受亚硝酸盐浓度限制；未利用沼气中的二氧化碳；未对三类微生物群体进行定量分析57–94毫克氮/升·天（去除效率为67%）Tentori等人，2024年2018–2021年实际污水处理厂产生的侧流废水，未经稀释；直接使用污水处理厂产生的沼气；明确了由甲烷氧化菌、甲基嗜菌科细菌和伯克霍尔德氏菌群组成的三类微生物群体的动态变化；证实了通过卡尔文-本森-巴斯汉循环实现生物二氧化碳固定；同时证明了铵氮的直接同化与反硝化作用能够同步进行，总氮中有59%是通过铵氮同化与反硝化作用去除的Kim等人，2018年；2019a年；2019b年；2020年；2021年注：AME-D即兼性甲烷氧化与反硝化工艺；CBB即卡尔文-本森-巴斯汉循环；C/N即碳氮比；ME-SND即基于甲烷强化作用的同步硝化与反硝化工艺；MOB即甲烷氧化菌；n-DAMO即依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化工艺。各项性能指标均依据原始研究结果给出，不同研究因反应器结构及数据呈现方式的不同，存在差异，比如速率是按体积归一化还是按面积归一化。尽管已取得了一定进展，但仍有若干关键的知识缺口，阻碍了集成型、碳中和的侧流氮去除策略的实现。首先，尽管兼性甲烷氧化与反硝化工艺在亚硝酸盐生成方面具有功能重叠性，且能够更好地利用沼气，但目前还不存在用该工艺替代依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化工艺中部分亚硝酸化阶段的理论或工程框架。其次，目前尚未明确在高浓度侧流废水条件下，甲烷氧化菌、专性甲基氧化菌和氨氧化菌这三类微生物群体之间的交叉供养机制，以及这种机制如何影响氮去除效率。第三，目前对于侧流废水中的天然微量营养元素、沼气中的二氧化碳以及稀土元素的存在对维持整体微生物群落的积极作用，了解还不够深入，也缺乏相应的量化操作指南。第四，目前还没有任何研究将同时回收甲烷衍生的生物产品与侧流氮去除结合起来，作为城市污水处理领域实现循环生物经济的统一解决方案。鉴于上述情况，本综述汇总了现有的实验和机制研究结果，评估了在两级兼性甲烷氧化与反硝化/依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化集成工艺中，用兼性甲烷氧化与反硝化工艺替代传统部分亚硝酸化反应器以实现碳中和侧流氮去除的科学可行性。本综述为该领域做出了三方面的贡献：第一，系统总结了兼性甲烷氧化与反硝化工艺作为多功能上游处理阶段的优点，它能够在依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化工艺系统中实现原位亚硝酸盐生成、铵氮同化，以及为下游微生物群提供C1碳源；第二，基于在实际侧流废水和真实污水处理厂沼气条件下来验证的三类微生物群体动态及交叉供养机制，提出了兼性甲烷氧化与反硝化/依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化工艺整合的统一理论框架；第三，梳理出了实现该工艺所需的关键条件，包括微量营养元素的可用性、沼气成分、与nosZ基因相关的氮氧化物排放控制措施，以及生物产品的回收潜力，为构建碳中和的循环生物经济平台提供了完整的工艺设计与控制思路。本文的结构如下：第2节介绍兼性甲烷氧化与反硝化工艺以及依赖硝酸盐/亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化工艺所涉及的微生物和生化基础知识；第3节探讨侧流废水和沼气的特性以及它们与工艺的兼容性；第4节阐述两级集成工艺的设计方案及运行框架；第5节总结研究结论并指出未来的研究方向。2. 甲烷驱动的微生物群体基础2.1. 好氧甲烷氧化-反硝化工艺2.1.1. 系统发育分类与功能作用根据碳同化途径和系统发育特征，好氧甲烷氧化菌可分为I型、II型和X型。I型好氧甲烷氧化菌主要通过核酮糖单磷酸途径同化C1碳（Semrau等人，2010年；Rasigraf等人，2014年）。Kalyuzhnaya等人（2019年）对I型、II型和X型好氧甲烷氧化菌的系统发育和生理特性进行了全面总结。这类微生物包括甲基单胞菌属和甲基杆菌属，它们是推动甲烷氧化反应的关键物种，具备较强的代谢灵活性，即使在缺氧或厌氧条件下也能保持硝酸盐还原和反硝化功能（Kits等人，2015b年；Schorn等人，2024年）。正是由于这种多样性，它们有望成为甲烷驱动的氮去除系统中的重要功能菌株。II型好氧甲烷氧化菌属于α-变形菌门，包括甲基囊菌属和甲基辛菌属，这类细菌依靠丝氨酸途径进行代谢，由于能够在氮限制条件下（碳氮比超过20）积累干细胞重量30–60%的聚羟基丁酸，因此被视为重要的生物精炼厂微生物（Pieja等人，2011年）。X型好氧甲烷氧化菌的代表是荚膜甲基球菌，这类细菌同时拥有核酮糖单磷酸途径和卡尔文-本森-巴斯汉循环途径，能够直接固定二氧化碳，为细胞提供碳源以及聚羟基丁酸的前体物质（Hanson和Hanson，1996年；Baxter等人，2002年）。这些系统发育上的差异会直接影响工艺的运行效果：在侧流废水存在的环境中，氧气与甲烷的供应比例会决定各类好氧甲烷氧化菌的相对丰度。当氧气与甲烷的供应比例低于0.9时，I型好氧甲烷氧化菌占主导地位；而当比例高于1.1时，II型好氧甲烷氧化菌的占比会上升。因此，氧气与甲烷的供应比例是调控微生物群落结构及其功能表现的关键操作参数（Kim等人，2021年）。2.1.2.AME-D反应器中微生物群落的特征在先前的研究中（Kim等人，2020年；Kim等人，2021年），以沼气及废水为原料的AME-D反应器中会自然形成一种由三类微生物构成的共生群落：(i) 甲烷氧化菌（负责甲烷氧化并生成甲醇）；(ii) 甲醇氧化菌科（能够氧化甲醇，参与甲醇同化以及NH??-N的吸收）；(iii) 伯克霍尔德氏菌目（作为好氧反硝化菌，通过NapA介导的硝酸盐还原作用产生NO??）。对这些研究中的16S rRNA基因测序数据重新分析后发现，微生物组成会随着O?/CH?供应比的变化而发生规律性变化（见表2）。具体而言，当O?/CH?比在0.7到0.9之间时，甲醇氧化菌科占据主导地位，而当该比值超过1.1时，伯克霍尔德氏菌目的相对丰度则上升。这些发现表明，O?/CH?比率是调控AME-D系统中不同功能类群活性的重要参数。这种三类微生物的结构代表了以甲烷为驱动力的氮去除过程的最小功能单元，各类微生物各司其职：甲烷氧化菌负责甲烷氧化及C?中间体的提供；甲醇氧化菌科负责C?同化以及NH??-N的去除；伯克霍尔德氏菌目则通过双重反硝化作用将氮以NO??-N的形式输出到第二阶段。表2显示了AME-D反应器中微生物群落的变动情况，这些变动是与O?/CH?供应比相关的（数据基于16S rRNA基因分析的相对丰度）。| O?/CH? | 甲烷氧化菌 | 甲醇氧化菌属（MeOH-OB） | 伯克霍尔德氏菌目（AOB） | 甲基杆菌（I型） | 甲基肉芽杆菌（I型） | 甲基单胞菌（I型） | 甲基球菌（X型） | 甲基硬壁菌（X型） | 甲基囊菌（II型） | 0.6 | 31.9% | 15.4% | 35.8% | 20.7 | 28.1% | 32.7% | 93.3% | 2↑ | 20.9 | 32.1% | 16.1% | 23.2% | 26.1 | 1.1 | 30.7% | 11.5% | 21.2% | 91.3% | ↑ | 1.4 | 33.4% | 56.2% | ↑↑ | 注：数值表示相对丰度（%）。数据来自Kim等人（2021年）报告的原始16S rRNA基因测序数据。↑表示相对于之前的O?/CH?条件，相对丰度有显著上升；↓↓表示上升幅度更大。所有数值均为基于混合测序得到的结果，这是一种在微生物群落分析中常用的方法，其得到的群落内多样性和组成估计值与单独测序样本的结果相当（Ray等人，2019年；Gaire等人，2025年）。由于所报数值为每种条件下的单次混合测量结果，而非重复测量的平均值，因此无法使用传统的误差范围。MeOH-OB指甲醇氧化菌；AOB指氨氧化菌；MOB指甲烷氧化菌。1）甲醇氧化菌科的甲醇同化与氮代谢甲醇氧化菌科的成员属于专性甲基营养菌，它们仅以C?化合物作为碳源，同时充当连接甲烷氧化菌与反硝化菌的中间类群（Richter等人，2025年）。它们具有三种主要功能：i) 甲醇同化：依赖吡咯喹啉醌的甲醇脱氢酶将甲醇氧化为甲醛，随后通过核酮糖单磷酸途径将其转化为生物量（HCHO → H?P → F6P）；ii) 直接吸收NH??-N：通过GS–GOGAT途径，废水中的高浓度NH?-N可被转化为生物量，从而降低氮负荷；iii) 反硝化：甲烷氧化菌产生的剩余甲醇可作为电子供体，用于将NO??-N和NO??-N还原为N?（Xu等人，2020年；Zhu等人，2016年），从而实现甲烷氧化菌与甲醇氧化菌科之间的碳-氮耦合。2）伯克霍尔德氏菌目的双好氧-厌氧反硝化机制在之前的研究（Kim等人，2020年）中，随着O?/CH?比值的上升，伯克霍尔德氏菌目的相对丰度可增加29%，但其在富氧条件下的反硝化作用机制一直不明，直到Wu等人（2024年）从分子层面揭示了这一机制：AOB类的Pelomonas puraquae WJ1利用周质内的硝酸盐还原酶napA，而非对氧气敏感的膜结合型Nar酶，因此即便在溶解氧浓度较高（约7.8毫克/升）的情况下，仍可通过napA–nirS–nosZ途径实现反硝化作用（Wu等人，2024年）。对Kim等人（2021年）的研究重新分析后发现（补充材料1为独立的HTML文件，可在任何标准网页浏览器中查看），当O?/CH?比为1.2时，P. puraquae在伯克霍尔德氏菌目群落中占比达57%，这与纯培养实验的结果一致。虽然纯培养研究提供的分子证据为这里的NapA驱动的好氧反硝化机制提供了依据，但在实际废水处理条件下进行转录组学和蛋白质组学的直接验证尚未开展，这被视为未来实验工作的重点，有助于明确哪些机制已经得到证实，哪些仍需现场验证。下载：下载高分辨率图像（454KB）下载：下载全尺寸图像图1. 好氧甲烷氧化-反硝化（AME-D）系统中的三类微生物群落。(a) 甲烷氧化菌（I型/II型/X型）、甲醇氧化菌科以及伯克霍尔德氏菌目的系统发育分类；(b) 在废水处理条件下一级伯克霍尔德氏菌目的物种组成，数据来自Kim等人（2021年）的研究（完整数据集以交互式Krona可视化形式存在于补充材料1中，该文件为独立HTML格式，可在任意标准网页浏览器中查看）。伯克霍尔德氏菌目的双重反硝化能力依赖于两种硝酸盐还原酶的氧敏感型互斥表达。这样一来，即便在AME-D阶段典型的高溶解氧条件下，由NapA驱动的亚硝酸盐生成过程也能持续进行。在好氧条件下，耐氧的周质内NapA可催化NO??-N向NO??-N的还原；而在厌氧条件下，则由膜结合型的NarGHIJ执行相同的初始反应。后续的还原过程则通过常见的反硝化途径（nirS/nirK → norBC → nosZ）进行，最终生成N?（Kim等人，2021年；Liu等人，2021年）。从氮去除效率来看，当O?/CH?比值高于1.1时，反硝化作用会受到好氧呼吸的竞争限制。相反，当比值低于0.9时，通过NarGHIJ介导的厌氧反硝化作用以及甲烷氧化菌的甲醇交叉供给作用，氮去除效率可达最佳。总体而言，AME-D三类微生物系统中的碳-氮循环过程可概括为：甲烷氧化菌氧化甲烷→分泌甲醇和甲酸→甲醇氧化菌科吸收NH??-N并进行反硝化→伯克霍尔德氏菌目通过NapA/NarGHIJ实现双重反硝化→生成NO??-N→为第二阶段的n-DAMO提供底物。这一整体流程如图2所示。下载：下载高分辨率图像（463KB）下载：下载全尺寸图像图2. 三类微生物组成的AME-D系统中的碳-氮循环及受O?/CH?比例影响的反硝化作用切换。上方：甲烷氧化菌通过甲醇氧化菌科向伯克霍尔德氏菌目提供甲醇，同时将NO??输出到第二阶段（n-DAMO，即依赖亚硝酸盐/硝酸盐的厌氧甲烷氧化作用）。下方：伯克霍尔德氏菌目中NapA（好氧条件，O?/CH? > 1.0–1.1）与NarGHIJ（厌氧条件，< 0.9）的路径选择。2.1.3 甲烷衍生的生物制品除了具备氮去除功能外，第一阶段AME-D反应器产生的生物量还可作为生产高附加值生物制品的原料，包括聚羟基丁酸酯、胞外聚合物、单细胞蛋白以及生物气转液法的原料。重要的是，这一资源的回收与氮去除过程是相辅相成的，而非相互竞争的；它能够充分利用过剩的C?碳源及收获的多余生物量，避免占用反硝化作用所需的电子供体，从而在核心处理功能之外又增加了碳资源利用的功能（Kalyuzhnaya等人，2015年）。II型甲烷氧化菌在氮限制条件下会积累聚羟基丁酸酯，I型生物膜则倾向于生成胞外聚合物，而持续的生物量收集则有利于单细胞蛋白及生物气转液法原料的获取。由于关于生产条件、生产效率、市场应用及相关参考文献的详细内容超出了本综述关于氮去除主题的范围，因此这些内容将在补充材料S3中单独介绍。2.2.2 n-DAMO工艺的特性2.2.1 微生物机制与生化特性n-DAMO工艺是由两类功能不同的微生物群体共同实现的（Hu等人，2015年；Shen等人，2013年）。这一工艺最初是在一种混合富集培养物中被发现的（Raghoebarsing等人，2006年）。后来人们确定Ca. Methylomirabilis oxyfera（NC10门，亚硝酸盐-DAMO细菌）是这一过程的负责菌种（Ettwig等人，2010年），这一发现从根本上颠覆了长期以来认为分子氧是生物甲烷氧化必需条件的观点。这类微生物采用一种内源好氧途径，首先通过亚硝酸盐还原酶将亚硝酸盐还原为一氧化氮，随后一氧化氮歧化酶会将两个一氧化氮分子转化为氮气与氧气（2NO → N? + O?，Wu等人，2011年）。内部生成的氧气会被直接输送给颗粒状甲烷单加氧酶，用于甲烷的好氧活化，从而完成整个内源好氧循环，无需与外界环境进行氧气交换。该反应的总体化学计量式为：3CH? + 8NO?? + 8H? → 3CO? + 4N? + 10H?O（Ettwig等人，2010年）。这种独特的机制被称为“内源好氧途径”（Ettwig等人，2010年；Wu等人，2011年），它的发现为厌氧碳-氮循环提供了新的理论框架，同时也可直接应用于废水处理领域。第二类微生物则是厌氧甲烷氧化古菌（ANME-2d谱系，硝酸盐-DAMO古菌），代表菌种为Ca. M. nitroreducens。这类古菌通过逆甲烷生成途径氧化甲烷，以硝酸盐作为最终的电子受体。其总体反应式为：5CH? + 8NO?? + 8H? → 5CO? + 4N? + 14H?O（Haroon等人，2013年）。此外，它们还会产生甲酸和乙酸作为代谢副产物，这些物质可作为共存的异养反硝化菌的碳源，从而促进微生物群落间的交叉供给作用（Guo等人，2023年；Haroon等人，2013年）。2.2.2 n-DAMO与厌氧氨氧化的耦合及交叉供给网络亚硝酸盐-DAMO细菌、硝酸盐-DAMO古菌以及厌氧氨氧化细菌之间的协同作用，使得仅需以甲烷作为唯一的电子供体，就能将NH??-N以及NO??-N/NO??-N完全转化为氮气，而且无需外部碳源（Shi等人，2013年；Ettwig等人，2010年；Haroon等人，2013年；van Kessel等人，2018年）。Shi等人（2013年）在MBfR系统中证明，这三类微生物各自约占微生物群落的20–30%，并且能够同时实现硝酸盐和铵的去除。Nie等人（2021年）进一步发现，Ca. Methanoperedens既能进行反硝化作用（将NO??-N转化为N?），又能进行硝酸盐向铵的异化还原作用（DNRA，即将NO??-N转化为NH?-N）。这种DNRA途径为厌氧氨氧化细菌提供了NH??-N这一关键底物，从而使整个系统形成一个无需外部氮输入即可自我维持的反硝化-厌氧甲烷氧化-DNRA-厌氧氨氧化耦合网络。在这个群落中，亚硝酸盐是所有微生物共用的底物，亚硝酸盐-DAMO细菌与厌氧氨氧化细菌会为此相互竞争；竞争的最终结果取决于二者对亚硝酸盐的亲和力以及当地亚硝酸盐的供应速率。硝酸盐-DAMO古菌可以通过将硝酸盐重新转化为亚硝酸盐来缓解这种竞争（在某些条件下，它们还会将电子导向硝酸盐向铵的异化还原作用，进而为厌氧氨氧化提供能量），从而在各类微生物之间分配氮素流量，避免直接的竞争（Nie等人，2021年；Guo等人，2023年）。因此，保持亚硝酸盐供应的平衡对于维持第二阶段群落的稳定共存至关重要。从第一阶段（AME-D）进入第二阶段时，若残留的甲醇浓度超过大约0.5毫摩尔的阈值，就有可能对厌氧氨氧化细菌造成不可逆的抑制作用（Güven等人，2005年）。不过，第二阶段中存在的甲基营养型反硝化菌——主要是Hyphomicrobium和Methylovorus——可以优先消耗残留的甲醇作为反硝化作用的电子供体，从而缓解这一风险。这些菌株起到了现场生物缓冲的作用，能够在甲醇浓度达到抑制厌氧氨氧化细菌的水平之前将其截留（Xu等人，2020年；Liu等人，2021年；Guo等人，2023年）。此外，还可以在第一阶段AME-D反应器中主动控制甲醇的积累。如果出水中的甲醇浓度接近抑制阈值，可以通过减少沼气输入以提高O?/CH?比率，促使当地的甲醇同化反硝化菌甲醇氧化菌消耗多余的甲醇。研究表明，甲醇氧化菌在AME-D群落中通常与其它微生物共存，一旦甲醇被耗尽，其丰度也会下降（Kim等人，2020年）。这就为将第一阶段出水中的甲醇浓度维持在低于抑制厌氧氨氧化细菌的阈值提供了操作手段。这种甲醇清除功能为第二阶段群落增加了另一层交叉供给机制，既有助于氮的去除，又能保护厌氧氨氧化细菌的活性。除此之外，共存的异养反硝化菌（如Arenimonas和Thauera）可以利用来自第一阶段以及n-DAMO代谢过程的甲酸、乙酸，还有残留的甲醇，这些物质可再帮助实现约17%的氮去除（Guo等人，2023年）。这种微生物缓冲结构不仅能够防止甲醇对厌氧氨氧化细菌的抑制作用，还能提升整体的反硝化效率（Isaka等人，2008年）。要维持这一层级分明的微生物网络的稳定性，就需要足够的固体停留时间，以便让生长缓慢的微生物得以存活（Guo等人，2023年；Yan等人，2022年），第二阶段具体的固体停留时间要求（≥30天）将在4.5.2节中详细说明。3. AME-D/n-DAMO工艺的机制整合2.3.1 整合型微生物系统中的铜元素与稀土元素调控机制甲烷氧化代谢的前两个步骤，即CH? → CH?OH（由甲烷单加氧酶催化）以及CH?OH → HCHO（由甲醇脱氢酶催化），分别受到铜元素和稀土元素的严格调控。这两种调控“开关”是优化废水处理过程的关键控制因素（Culpepper和Rosenzweig，2012年；Keltjens等人，2014年）。它们的功能特点如下：铜元素开关（决定MMO酶的类型）：pMMO是一种依赖铜元素的膜结合酶。废水中的天然铜含量足以维持以pMMO为主导的代谢环境，无需额外添加铜元素（Semrau等人，2010年）。与之下，在铜浓度较低（<0.8 μM）的条件下表达的可溶型MMO会催化NH?的非特异性氧化，从而生成有毒的羟胺（NH?OH）（Murrell等人，2000年）。除了MMO的选择之外，铜的可用性还会影响后续的甲醇代谢：在Methylosinus trichosporium OB3b中，铜会显著调节微生物对甲醇的转录组及生理反应，并通过改变还原力与甲酸平衡来限制以甲醇为能源的生长（Peng和Semrau，2026年），这表明铜的调控作用贯穿CH?→CH?OH→HCHO这一整个代谢序列，而不仅仅作用于MMO本身。因此，维持pMMO占主导的地位是处理高浓度NH??-N废水时确保工艺稳定的关键前提。

REE开关（MeDH酶的选择）：MeDH存在两种形式：(1)依赖Ca2?的MxaF-MeDH，以及(2)依赖REE的XoxF-MeDH（由xoxF基因编码的甲醇脱氢酶，以下简称XoxF-MeDH）。后者具有更高的催化效率，能够快速氧化甲醇并防止其积累产生毒性（Keltjens等人，2014年）。Ca. M. oxyfera编码一种mxaFI型MDH以及两种XoxF型MDH（xoxF1和xoxF2），但它缺乏吡咯喹啉醌（PQQ）生物合成的相关基因，因此必须依靠外部提供的PQQ（Wu等人，2015年）。

在以往关于污水处理厂中稀土元素在液体与污泥相之间分布的研究中，废水中镧（La）的浓度被间接估算在0.007到0.35 μM之间（Turcotte等人，2022年；Kaegi等人，2021年）。这一数值可能低于XoxF-MeDH的激活阈值（约0.1 μM）（Vu等人，2016年）。而在实际的稀土尾水中，稀土元素的浓度已达到能够直接影响生物脱氮过程的水平（Zhang等人，2025年），这为有必要在废水条件下量化La3?/Ce3?的生物有效性提供了实证依据。

在稀土元素不足的情况下，依赖MxaF-MeDH会导致甲醇氧化速度变慢，pMMO与MDH之间的电子传递受到干扰，整体甲烷氧化速率也会下降。这种失衡可能引发一系列工艺抑制效应：NO??-N反硝化效率降低→NO??-N积累→抑制Ca. Methanoperedens的生长（当NO??浓度超过2–5 mM时），同时游离亚硝酸的毒性也会影响厌氧氨氧化细菌的活性（当氮浓度超过0.02 mg/L时）（Fan等人，2023年）。由Cu2?和稀土元素的可利用性所调控的酶切换机制及其相关的毒性风险如图3所示。

图3. 甲烷氧化过程中Cu2?与稀土元素（REE）的调控作用。第一步：当Cu2?浓度≥0.8 μM时，pMMO占主导地位，工艺更稳定；当浓度<0.8 μM时，sMMO占优势，存在NH?OH毒性风险。第二步：稀土元素存在时，会选择效率更高的XoxF-MeDH；若稀土元素缺乏，则会选择存在甲醇积累风险的MxaF-MeDH。

尽管基于稀土元素的MDH系统非常重要，但该领域的研究仍处于初期阶段。尤其是目前还没有研究直接探讨在废水处理条件下La/Ce浓度与XoxF-MeDH表达之间的关联。这是本综述指出的一个重要知识空白，应作为未来研究的重点。第4.5.2.3.2节将在整体工艺控制的背景下，讨论针对稀土元素不足的具体操作策略，包括有针对性的La3?/Ce3?补充措施以及工艺监测指标。

AME-D/n-DAMO过程中的生物CO?固定机制

沼气中的CO?含量约为30–45%，它是AME-D/n-DAMO系统中自养微生物的共同碳源，使得这些微生物无需外部有机碳输入即可实现碳同化。甲基营养型微生物群（如Methylophilaceae科、Hyphomicrobium属）依赖于甲烷氧化菌提供的C?类中间产物（甲醇、甲酸），而非直接固定CO?。CO?固定途径可大致分为CBB循环和还原型乙酰辅酶A途径（Wood–Ljungdahl途径，简称WLP）（Rasigraf等人，2014年；Ettwig等人，2010年）。

CBB循环：X型MOB与Ca. M. oxyfera。X型MOB（如M. capsulatus）以及亚硝酸盐-DAMO细菌（如Ca. M. oxyfera）都采用以RuBisCO（Form I型；由cbbL/cbbS基因编码）为基础的CBB循环（Rasigraf等人，2014年；Ettwig等人，2010年）。在此途径中，CO?依次经过CO?→3-磷酸甘油酸→甘油醛-3-磷酸（G3P）→乙酰辅酶A的步骤被固定下来。由G3P生成的乙酰辅酶A还可直接作为PHB生物合成的前体。在MBfR运行条件下，溶解态CO?的浓度（约300–450 μM）高于RuBisCO的米氏常数（Km，约为240 μM），因此该酶能够接近饱和状态进行反应（Tabita等人，2007年）。Rasigraf等人（2014年）通过13C-碳酸氢盐标记实验确认，CO?是Ca. M. oxyfera的主要碳源。

还原型乙酰辅酶A途径（WLP）：在厌氧条件下，Ca. M. nitroreducens以及厌氧氨氧化细菌（如Ca. Brocadia属、Ca. Kuenenia属）仅通过WLP途径固定CO?（Strous等人，2006年）。CO?进入CODH/ACS复合体后会被还原为乙酰辅酶A，用于生物量合成（He等人，2022年）。Lawson等人（2021年）通过同位素追踪和代谢通量分析证实了CO?向乙酰辅酶A的转化过程。与CBB循环相比，WLP途径所需的ATP更少，且只能在严格厌氧的环境中运作（见图4）。

图4. AME-D/n-DAMO过程中的碳同化机制。(a) 三条并行路径：路径A为RuMP途径（I型/X型MOB）；路径B为用于CO?固定和PHB合成的CBB循环（X型MOB）；路径C为用于生产生物甲醇的反向氧化途径。(b) CBB循环（如Ca. M. oxyfera；属于X型MOB）与Wood–Ljungdahl途径（如Ca. M. nitroreducens；属于厌氧氨氧化菌）的对比。

2.3.3. 兼性厌氧甲烷氧化菌与N?O呼吸作用

某些好氧型MOB具备兼性厌氧特性，能够在有氧以及低氧/厌氧环境中维持代谢活动（Kits等人，2015a年；Schorn等人，2024年）。由于AME-D生物反应器中N?O的动态变化在很大程度上取决于这类微生物是否携带nosZ基因，因此它们被分为两类。

(1) 携带nosZ基因的类型——具有N?O还原能力

从系统发育角度来看，nosZ基因可分为I支系（典型的反硝化菌，如Methylocystis属的α-变形菌）和II支系（非典型的、通常不具备完整反硝化功能的N?O还原菌，如M. album BG8菌株）。II支系的N?O还原酶通常具有更高的N?O亲和力，多存在于缺乏完整反硝化途径的微生物中，因此能有效地充当净N?O吸收剂。因此，在AME-D阶段，增加含有II支系基因的甲烷氧化菌有助于抑制净N?O的排放（Kits等人，2015b年；Awala等人，2024年）。Methylomicrobium album BG8菌株（属于II支系，带有nosZ基因）可以利用多种电子供体进行低氧条件下的反硝化作用，其与缺乏nosZ基因的菌株如Methylobacter属菌株共培养时，其N?O还原能力可有效抑制N?O的积累（Kits等人，2015a年；Kits等人，2015b年）。而Methylocystis属菌株虽属于I支系且也携带nosZ基因，但其能否在厌氧条件下利用N?O生长目前尚未得到实验证实（Awala等人，2024年）。

(2) 缺乏nosZ基因的类型——存在N?O积累的风险

在废水处理后的出水条件下，AME-D生物反应器中占主导地位的菌群是Methylobacter属菌株（属于I支系），它们占总微生物群的比例可达40–60%（Kim等人，2021年）。为抑制由缺乏nosZ基因的这类优势菌株所导致的N?O积累，有必要促进携带nosZ基因的菌株（如M. album BG8菌株和Methylocystis属菌株）的共存，并对排放气体中的N?O浓度进行持续监测（Intrator等人，2024年）（见图5）。在实际操作中，这需要增加含有II支系nosZ基因的菌株的比例，同时营造低氧环境，因为在这样的环境下，通过nosZ基因实现的N?O还原在热力学上更为有利，而持续检测排放气体中的N?O浓度则可作为关键的反馈信号。目前还无法确定具体的操作参数，比如固定的菌种来源或恒定的工艺参数；不过，目前还没有研究在真实的废水处理后的AME-D系统中实现可控的nosZ基因富集操作，这也是当前研究中的一个明显缺陷。因此，确定最佳的富集程度及操作条件被视为未来实验工作的重点，而本文所提供的指导更多是基于机制层面的建议，而非经过验证的标准化操作流程。

图5. nosZ基因的存在状态决定了AME-D生物反应器中N?O的命运。缺乏nosZ基因的菌株会积累N?O，而携带nosZ基因的菌株则可将N?O还原为N?。通过共同富集携带nosZ基因的菌株，可作为一种缓解N?O问题的策略。

2.3.4. n-DAMO工艺的发展阶段与实际应用状况

2021年，Lim等人首次使用真实废水在实验室规模上展示了n-DAMO工艺的可行性（Lim等人，2021年）。目前尚无关于该工艺在中试或大规模实际应用的相关报道。因此，n-DAMO技术的发展可分为以下几个阶段：发现阶段、实验室规模验证阶段，以及真实废水验证与工艺整合阶段。从技术成熟度来看，n-DAMO目前大约处于TRL 4–5阶段，即已在相关环境中完成了实验室或试验台级的验证，但尚未有超出试验台规模的示范案例；而要迈向中试阶段（TRL 6–7），则面临生物量生长缓慢、易被冲走、膜污染等问题，这些问题将在后文详细阐述。

实验室规模验证阶段（2011–2017年）：Luesken等人（2011年）成功从污水处理厂的污泥中分离出了亚硝酸盐-DAMO细菌，证明了这类细菌在废水环境中的应用潜力。Shi等人（2013年）在MBfR系统中证明，三种不同的微生物群落（每种约占整个微生物群落的20–30%）能够同时去除废水中的NH??-N和NO??-N。Haroon等人（2013年）发现了硝酸盐-DAMO古菌（如Ca. M. nitroreducens，即ANME-2d菌株），揭示了一种包含直接硝酸盐还原在内的两步式反硝化系统。Xie等人（2018年）在经过优化的MBfR系统中实现了超过0.2 kg N/(m3·d)的总氮去除率。

真实废水验证与工艺整合阶段（2021年至今）：Lim等人（2021年）首次使用真实废水展示了n-DAMO工艺的实用性，他们在MBfR系统中实现了96%的总氮去除率，即每立方米水可去除0.5 kg氮。Fan等人（2023年）证明，通过PN/A–n-DAMO组合工艺，可在单个MABR系统中同时实现超过90%的溶解态CH?和NH??-N的去除，这一成果也得到了Lu等人（2024年）的进一步验证。Tentori等人（2024年）则证明了基于好氧型MOB的MBfR工艺在去除厌氧消化液中的高浓度铵盐方面的可行性。

尽管取得了这些进展，但要实现从试验规模向更大规模的过渡，仍面临若干关键障碍：微生物的生长速度极慢（倍增时间从几天到几周不等，因此需要保持SRT值在30天以上）、生物量容易被冲走、膜容易发生污染，此外还需要在系统前端设置PN预处理装置（Fan等人，2023年；Tentori等人，2024年）。通过采用本研究提出的AME-D/MBfR组合工艺来替代传统的PN预处理步骤，可以有效缓解上述问题。此外，如果能够从AME-D阶段持续向n-DAMO工艺供应兼性厌氧微生物（如MOB、AOB以及Burkholderiales类微生物），也有助于提高微生物在系统中的停留时间并增强系统的功能稳定性。

3. 废水与沼气的特性及其与工艺的兼容性

3.1 废水的特性及其与工艺的兼容性

废水中较高的NH??-N浓度可直接作为甲烷氧化菌（MOB）的碳源，这类微生物主要通过GS–GOGAT途径将NH??-N转化为生物量，而谷氨酸脱氢酶途径则作为次要的代谢途径（Liu等人，2021年）。不过，这类微生物的代谢能力会受到浓度相关毒性阈值的限制，这些阈值决定了该工艺在第二阶段运行的可行性。虽然废水中的NH??-N浓度较高，可达约500–1,200 mg/L，即约36–86 mM，如果直接引入第二阶段，可能会抑制微生物的活性，但Wissink等人（2024年）的研究表明，在NH??-N浓度高达10 mM（约合140 mg/L）时，n-DAMO微生物群的厌氧甲烷氧化活性并不会受到显著影响，其IC??值约为52 mM。这说明在典型的城市废水条件下（NH??-N浓度约为2 mM），n-DAMO工艺仍可正常应用。在所设计的工艺流程中，第二阶段接收的是第一阶段AME-D处理后的出水，此时大部分的NH??-N已经被去除或同化，因此进入第二阶段的NH??-N浓度仅为40–65 mg/L（Kim等人，2020年；Kim等人，2021年），远低于可能抑制微生物活性的浓度水平。

废水中溶解态铜的浓度为50–500 μg/L，即0.8–7.9 μM（Genz和Reemtsma，2022年），这一浓度已经满足pMMO优先表达的条件（铜浓度大于0.8 μM，详见2.3.1节），因此能够自然形成以pMMO为主导的微生物环境（Kim等人，2018年；Semrau等人，2010年）。此外，废水中重金属的浓度通常也低于甲烷氧化菌的毒性阈值（Semrau等人，2010年），因此不会对甲烷氧化生物反应器的性能造成负面影响。

废水的典型pH值范围为7.5–8.5（Fux和Siegrist，2004年），这一数值略高于pMMO活性最佳的pH范围（6.5–7.5）（Semrau等人，2010年）。不过，沼气中溶解的CO?具有一定的缓冲作用，可以缓解pH值的变化，而且在这样的条件下，pMMO的表达并未出现显著受抑的现象（Kim等人，2020年）。

3.2 沼气的组成、杂质含量以及对H?S的耐受性

沼气中的CH?在工艺的第一阶段和第二阶段中发挥着双重作用：在第一阶段，它是pMMO的氧化底物，其氧化阈值Ks约为8.3 μM（Lontoh和Semrau，1998年）；而在第二阶段，它则是n-DAMO工艺唯一的电子供体（Ettwig等人，2010年；Haroon等人，2013年）。同样，生物气中较高的二氧化碳含量（30–45体积%）在AME-D/n-DAMO系统中发挥着两大关键作用，这两者都是实现无需外部输入的循环生物经济模式的核心。通过CBB循环进行生物固定：X型移动微生物（M. capsulatus）含有RuBisCO（I型；Km(CO?)约为160–590微摩尔），在较高的二氧化碳分压下（溶解态二氧化碳约300–450微摩尔）能以接近最佳活性状态工作。据估计，有15–35%的输入二氧化碳通过这一途径被固定为生物质和PHB（Kim等人，2021；Tabita等人，2007）。pH值自我缓冲：二氧化碳的溶解反应（CO? + H?O ? HCO?? + H?；pKa?=6.35）可使反应器内的pH值维持在n-DAMO和厌氧氨氧化过程所需的最佳范围（7.0–8.0），从而无需额外添加碱性物质（Appels等人，2008）。生物气中通常含有500–2,000 ppm的硫化氢，它会与pMMO中的Cu2?和Fe辅因子以及Ca. Methylomirabilis的细胞色素c氧化酶结合，从而抑制甲烷氧化和厌氧呼吸。Forte和Giuffrè（2016）以及Cherosky和Li（2013）的研究表明，硫化氢在第二阶段直接接触时会导致微生物活性严重下降。不过，第一阶段的AME-D可能具有内在的缓冲能力，因为许多好氧甲烷氧化菌拥有硫化物：醌氧化还原酶，该酶可将硫化氢氧化为单质硫并实现解毒作用（Schmitz等人，2023）。从各阶段之间的关联来看，进入第二阶段的残留硫化氢会对严格厌氧的n-DAMO/厌氧氨氧化菌群构成威胁，因为硫化物会抑制依赖细胞色素的呼吸作用，并与微生物竞争电子受体。然而，第一阶段的AME-D生物膜可通过硫化物：醌氧化还原酶将硫化氢氧化为单质硫，从而起到主要的硫化氢吸附作用（Schmitz等人，2023），而耐硫化氢的甲烷氧化菌则进一步降低进入第二阶段的硫化氢浓度（Zhang等人，2016；Jiang等人，2023）。如果原始生物气中的硫化氢浓度超过约500 ppmv，建议采用上游脱硫措施（如铁基脱硫剂）来保障第二阶段的稳定性。对一种甲烷氧化菌群的动力学抑制分析表明，硫化氢是甲烷氧化的竞争性抑制剂，其抑制常数Ki约为360微摩尔，而甲烷半饱和常数Km约为184微摩尔（Lee等人，2015），这一数据为解释pMMO介导的甲烷氧化对硫化氢的敏感性提供了定量依据。

4. 整合型AME-D/n-DAMO两阶段工艺设计
4.1 n-DAMO基工艺的背景与设计转型需求
现有的PN/A类及n-DAMO基旁流处理工艺都存在一个共同的结构缺陷：它们与现场的生物气利用系统相互分离。在PN/n-DAMO配置中，上游的PN反应器仅起到亚硝酸盐供应的作用，消耗氧气能量，却无法实现碳回收或甲烷利用（Fan等人，2023；Tentori等人，2024）。本节将阐述用具有多重功能的AME-D取代PN作为上游处理阶段的设计思路。
4.2 从PN/n-DAMO向AME-D/n-DAMO转型的理由
这里提出的核心理念是用AME-D反应器替代传统的PN反应器，将第一阶段从一个单纯的NO??-氮供应环节转变为兼具碳氮转化功能的复合阶段。PN反应器仅能实现NH??-氮的氧化，而AME-D则能同时完成以下功能：（i）通过pMMO介导的NH?共代谢产生内源性的NO??（Semrau等人，2010）；（ii）直接同化NH??-氮（Kim等人，2020）；（iii）生成C?中间体，为下游微生物提供养分（Liu等人，2021）；（iv）引入兼性甲烷氧化菌，促进n-DAMO菌群的协同作用（Kim等人，2021）。因此，AME-D可作为多功能生物工艺核心，扩展第一阶段的功能，实现氮去除与碳资源利用的双重目标（见图6）。
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图6. AME-D/n-DAMO两阶段工艺替代传统部分亚硝化工艺的概念图。第一阶段（AME-D，由三类微生物组成的菌群）可同时处理废水中的铵盐（NH??）和生物气中的甲烷/二氧化碳，第二阶段（n-DAMO）则通过DAMO细菌（Ca. Methylomirabilis）、DAMO古菌（Ca. Methanoperedens）以及厌氧氨氧化菌（Ca. Kuenenia；Ca. Jettenia；Ca. Scalindua）实现彻底的氮去除。
研究表明，在高NH??-氮浓度条件下，AME-D会形成由甲烷氧化菌、Methylophilaceae科微生物以及Burkholderiales科微生物构成的相互依存的三元菌群，从而实现铵盐的同化与反硝化的同步进行（Kim等人，2021）。Methylophilaceae科微生物可通过快速消耗残留的甲醇来调节碳流（Kim等人，2020；Guo等人，2023），而Burkholderiales科微生物则可通过耐氧的好氧反硝化途径（NapA途径）和厌氧反硝化途径（NarGHIJ途径）参与反硝化过程（Wu等人，2024）。因此，AME-D/n-DAMO转型?结构基础并非仅仅在于改变NOx物质的供应方式，而是将第一阶段转变为一个能够同时调控氮负荷降低与碳中间体分配的生态调节阶段。
关于亚硝酸盐供应的问题可能存在一定的逻辑疑问，需要明确说明的是，两种可能的亚硝酸盐生成反应对底物的要求截然不同。此处处理的废水以NH??为主（浓度为500–1,200毫克氮/升），几乎不含NO??；因此，以NO??为底物的NapA途径不可能成为AME-D阶段亚硝酸盐生成的主要途径。所以我们对亚硝酸盐生成反应的优先级作如下说明：众所周知，在好氧条件下，甲烷氧化菌可以从氨和硝酸盐两种底物中生成亚硝酸盐作为中间产物：由于甲烷和氨在结构上较为相似，广谱底物型的颗粒状甲烷单加氧酶会将NH?氧化为羟胺（NH?OH），随后羟胺氧化还原酶会将羟胺进一步氧化为亚硝酸盐，而与甲烷氧化菌相关的反硝化酶则能够实现NO??和亚硝酸盐之间的相互转化（Semrau等人，2010）；针对这类菌群，通过pMMO和HAO途径实现甲烷/氨向亚硝酸盐转化的机制也已被详细研究过（Kim等人，2020）。在当前没有NO??、以NH??为主的环境中，亚硝酸盐是通过两种互补的铵盐氧化途径生成的，而非通过硝酸盐还原产生。首先，I型甲烷氧化菌会通过上述的pMMO/HAO序列共同氧化NH?（Semrau等人，2010；Kim等人，2020）。其次，Burkholderiales科中占主导地位的好氧铵盐氧化菌（如Pelomonas属微生物）会在AME-D阶段的好氧环境下直接将NH?部分氧化为亚硝酸盐（Wu等人，2024）。这两种途径都会消耗NH??/NH?，且完全适用于这种废水环境，同时也不需要先进行硝酸化处理，因此无需专门的PN型处理单元。由此产生的少量亚硝酸盐还可能进一步被氧化为NO??，但生成的NO??数量极少且仅为暂时性的，随后会被Burkholderiales科微生物的NapA/NarGHIJ系统内部循环利用；因此NapA实际上只起到辅助性的NO???亚硝酸盐循环作用，它利用的是内部生成的NO??，而非外部输入的硝酸盐，所以并不作为亚硝酸盐的主要来源（Wu等人，2024）。在这种工艺体系中，AME-D阶段是通过铵盐的部分氧化来生成亚硝酸盐的，这是AME-D三元菌群固有的亚硝化功能，并非通过硝酸盐还原实现；因此并不存在所谓的矛盾：NapA并非亚硝酸盐的来源，而这种固有功能也不属于独立的专用PN处理单元。由于后续的亚硝酸盐-DAMO/厌氧氨氧化步骤必须以亚硝酸盐为依赖，此前在未稀释的废水中观察到的显著总氮去除效果（Kim等人，2020；Kim等人，2021）为现场生成亚硝酸盐提供了有力的间接证据。不过，由于总氮去除也可以通过直接铵盐同化与异养反硝化实现，因此要确定真正进入后续阶段的亚硝酸盐总量，还需要通过直接的亚硝酸盐质量平衡分析，将铵盐同化导致的氮去除与净亚硝酸盐输出区分开来。由于亚硝酸盐是一种暂时性物质，且会对甲烷氧化菌造成毒性，相关研究中很少将其作为独立检测指标，也未对其含量进行单独测定。因此，我们认为未来验证这一工艺方案的首要任务，是建立直接的、可实时监测的亚硝酸盐平衡体系，并明确pMMO/HAO途径与NapA途径各自的贡献程度。
4.3 两阶段工艺的优势以及实施MBfR的必要性
尽管单阶段集成生物膜工艺因简化系统结构而受到关注，但在同一生物膜中，氧气、甲烷、NH??-氮、NO??-氮和NO??-氮会同时发生扩散和消耗，这使得工艺的稳定性在很大程度上取决于氧气梯度与微观环境控制水平（Lu等人，2024）。生物气成分、氮负荷以及溶解氧的变化都可能加剧不同微生物群体之间的底物竞争，增加工艺控制的难度。相比之下，两阶段工艺将第一阶段和第二阶段物理上分开，从而可以独立控制各种选择压力与操作条件（Fan等人，2023；Lu等人，2024）。这种分离对于维持生长缓慢的n-DAMO菌群和厌氧氨氧化菌群的长期稳定至关重要。
要使这一工艺体系正常运行，就必须应用MBfR技术。MBfR的无气泡气体输送方式能够最大限度地减少甲烷的流失，同时保持溶解态底物的稳定性，还能精确控制氧气与甲烷的比例，而这一比例决定了第一阶段微生物群落的构成（Zhu等人，2017；Xu等人，2020）。与直接通入气体相比，MBfR能够将溶解态甲烷的浓度维持在高于pMMO半饱和浓度的水平（Modin等人，2008）。第二阶段需要较长的水力停留时间（≥30天），这样才能满足生长缓慢的n-DAMO菌群和厌氧氨氧化菌群的生长需求，同时确保稳定的甲烷供应，进而维持这些微生物之间的共生关系（Shi等人，2013）。因此，MBfR并非仅仅是反应器的一种选择，更是两阶段工艺设计中的核心支撑要素。
4.4 第一阶段AME-D与第二阶段n-DAMO之间的功能分工与底物耦合
第一阶段（AME-D）具有双重功能：它既作为上游氮去除单元发挥作用，同时也充当底物调控模块，负责调节输送到第二阶段（n-DAMO）的碳元素与氮元素的种类及浓度。甲烷氧化菌会消耗甲烷，而NH??-氮则通过同化作用以及pMMO介导的共代谢作用被去除，同时会产生NO?–N和C?中间体（Kim等人，2020；Liu等人，2021）。如4.2节所述，Methylophilaceae科微生物的甲醇缓冲作用以及Burkholderiales科微生物的双重反硝化功能，共同使得第一阶段从一个简单的氧化单元转变为具备多层功能的氮转化反应器（Liu等人，2021；Xu等人，2020）。
第二阶段（n-DAMO）是由Ca. Methanoperedens、Ca. Methylomirabilis（Ettwig等人，2010）以及厌氧氨氧化菌组成的三元菌群，它的功能直接依赖于第一阶段所形成的进水条件（Shi等人，2013；Haroon等人，2013）。
在这一阶段，甲烷作为电子供体，用于依次还原NO??-氮和NO??-氮，最终通过与厌氧氨氧化菌的协同作用，实现总氮向氮气的最大转化率。第一阶段产生的残留中间体以及微量氧气会显著影响整个菌群的稳定性（van Kessel等人，2018），这进一步凸显了将两个阶段视为紧密耦合的系统的重要性。其中一个关键的约束条件是，需将进水中的甲醇浓度控制在不会导致厌氧氨氧化菌不可逆抑制的阈值以下，该阈值为0.5毫克/毫升，相当于16毫克氮/升（Güven等人，2005）。这就要求在第一阶段实现甲醇的产生与消耗之间的平衡，同时还需要足够的水力停留时间（10–20天），才能维持Methylophilaceae菌群的数量（Guo等人，2023）。生物气中的二氧化碳可通过碳酸平衡实现自我缓冲，无需额外添加碱性物质即可将pH值维持在7.0–8.0的范围（Appels等人，2008）。因此，底物耦合应被视为一种综合策略，涵盖碳流管理、电子供体供给以及pH值控制等多个方面。
4.5 关键操作参数与控制层级
第一阶段的主要控制变量是氧气与甲烷的供应比例以及水力停留时间，第2.1.2节已经详细阐述了这些参数对微生物群落结构以及不同微生物群体功能的调控机制（Zhu等人，2017；Kim等人，2021）。当氧气与甲烷的供应比例为0.25（体积比）时，甲烷氧化菌与反硝化菌之间的协同作用达到最佳状态（Zhu等人，2017），而10–20天的水力停留时间则是维持Methylophilaceae菌群占比在20–35%范围内的最低要求（Kim等人，2020；Guo等人，2023）。
第二阶段的次要控制变量是水力停留时间与pH值。由于n-DAMO菌群和厌氧氨氧化菌的倍增时间较长，为14–30天，因此必须保持至少30天的水力停留时间（Ettwig等人，2010）。如果无法维持这一条件，整个三元菌群可能会发生不可逆的崩溃（Fan等人，2023）。生物气中的二氧化碳能够使pH值自我缓冲在7.0–8.0范围内，这一数值恰好是n-DAMO菌群与厌氧氨氧化菌的最佳共存范围，因此无需额外添加碱性物质即可维持第二阶段的稳定性，这也是该工艺的重要优势之一（Appels等人，2008）。
其他辅助变量，如稀土元素补充、碳氮比控制、硫化氢耐受性以及N?O废气监测，也都是影响工艺稳定性以及实现高附加值资源回收的关键管理因素。这些因素的优化范围及操作依据总结在表3中。整体的控制层级如下：第一阶段微生物群落调控 → 各阶段之间甲醇浓度的控制 → 第二阶段的稳定性维持 → 辅助功能的管理。具体而言，当进水中的La3?/Ce3?浓度低于XoxF-MeDH的激活阈值（约0.1 μM；见2.3.1节）时，建议将浓度调整至0.1–1 μM的目标范围（见表3），同时需定期监测溶解态稀土元素和出水中的甲醇含量，以此作为MeDH功能受限的早期预警指标。这一操作指南实际上是基于2.3.1节中提到的策略制定的。由于目前还缺乏针对废水的剂量-反应数据，该策略更适合作为在试点运行过程中需要不断调整的实际控制框架，而非固定的标准值。因此，建立La/Ce的定量剂量-反应关系被列为未来实验工作的重点。

表3. AME-D/n-DAMO两阶段集成工艺中关键操作条件的优化范围

| 参数 | 最佳范围 | 原因/操作意义 | 参考文献 |
|------------|----------------|-----------------------------------|------------------------------|
| O?:CH?供给比 | 10.25 v/v | 最佳化甲烷氧化、甲醇回灌以及NapA/NarGHIJ反硝化作用；过量氧气会导致甲醇溢流到第二阶段 | Zhu等，2017；Kim等，2021 |
| SRT——第一阶段（MOB反应器） | 110–20天 | 保持嗜甲烷菌的相对丰度在20–35%之间；否则会削弱甲醇缓冲能力，进而可能抑制第二阶段的厌氧氨氧化作用 | Kim等，2020；Guo等，2023 |
| SRT——第二阶段（n-DAMO反应器） | ≥30天 | n-DAMO的倍增时间为14–30天；SRT低于30天可能导致微生物群落不可逆崩溃，需同时维持厌氧氨氧化作用 | Ettwig等，2010；Fan等，2023 |
| 稀土元素补充（La3?/Ce3?） | 10.1–1 μM | 通过镧系元素切换激活XoxF-MeDH，加速甲烷氧化并降低甲醇毒性风险；单独依靠废水中的稀土元素通常不足 | Pol等，2014；Chistoserdova，2016 |
| C/N比（PHB合成诱导） | >20 | 当氮限制存在时，碳流会通过丝氨酸途径转向PHB合成（II型MOB：占干细胞重的30–60%）；X型MOB通过CBB途径固定CO?，进一步提升PHB产量 | Pieja等，2011；Wendlandt等，2001 |
| 第二阶段入口处甲醇浓度 | <0.5 mM（<16 mg/L） | 该浓度是防止厌氧氨氧化菌被不可逆抑制的临界值；好氧反硝化菌会优先消耗剩余甲醇，从而避免级联抑制效应；需在第一阶段出水处实时监测甲醇浓度以实现过程控制 | Xu等，2020；Isaka等，2008 |
| 第二阶段pH值 | 27.0–8.0 | 生物气中的CO?可提供自然缓冲作用（CO? + H?O ? HCO?? + H?）；该pH值既适合n-DAMO反应器，也适合厌氧氨氧化菌生长，无需额外添加碱剂 | Appels等，2008 |
| 生物气中的H?S浓度 | <500 ppmv（普通菌株） ≤3,000 ppmv（耐受菌株） | 普通MOB菌株在H?S浓度超过500 ppmv时会被抑制；而耐H?S菌株（如Methylocaldum sp. SAD2）可使生物气不经脱硫即可直接使用 | Zhang等，2016；Jiang等，2023 |
| N?O废气监测 | 持续监测 | nosZ?菌株的富集（如Methylomicrobium album BG8和Methylocystis spp.）对减少温室气体排放至关重要 | Kits等，2015a；Awala等，2024 |

注：CBB途径指Calvin-Benson-Bassham途径；C/N比为碳氮比；DCW指干细胞重量；GHG指温室气体；MOB指甲烷氧化菌；NapA指周质硝酸盐还原酶；NarGHIJ指呼吸型硝酸盐还原酶复合物；n-DAMO指依赖亚硝酸盐/硝酸盐的厌氧甲烷氧化作用；PHB指聚羟基丁酸酯；pMMO指颗粒状甲烷单加氧酶；REE指稀土元素；SRT指固体停留时间；XoxF-MeDH指由XoxF编码的甲醇脱氢酶。

4.6. 与传统技术相比，该集成工艺的优势

AME-D/n-DAMO两阶段MBfR系统的独特之处在于，它并非简单地替代外部碳源，而是利用现场产生的生物气CH?作为自供底物，实现氮去除、碳固定及生物产物回收的同时进行。传统的硝化/反硝化工艺依赖于外部碳源，如甲醇（Fux等，2002），而PN/A（脱氨）工艺则不涉及生物气利用或副产物回收（Lackner等，2014）。需要注意的是，与PN工艺不同，AME-D阶段需要持续供应现场的CH?。但由于该工艺适用于中大型城市污水处理厂，且仅需利用厌氧消化池产生的少量生物气来同时为第一阶段的AME-D反应器和第二阶段的n-DAMO反应器供能，因此供应稳定性并非主要问题。尽管如此，为应对生物气供应不稳定或不足的情况，未来研究应进一步评估并加强生物气储存及缓冲设施的设计能力。由于本文属于综述性质而非建模研究，此处仅从定性角度分析敏感性问题，未来需针对生物气供应量变化开展正式的定量敏感性分析，以服务于技术经济研究。

为便于与传统工艺进行对比，表4从能源、碳足迹及启动时间三个维度对比了AME-D/n-DAMO工艺与基于PN的工艺，表5则总结了五种主要工艺配置的五项评估指标。

表4. AME-D/n-DAMO与基于PN的旁流工艺的定性对比（能源、碳足迹、启动时间）

| 评估指标 | PN/AP | PN/n-DAMO | AME-D/n-DAMO（本综述） |
|----------------------|------------------|--------------------|----------------------------|
| 外部碳源 | 无 | 无 | 无（生物气CH?自供） |
| 曝气能耗 | 较低（较N/DN低约60%） | 需要曝气 | 降低（无曝气或接近无曝气） |
| 生物气价值利用 | 无 | 无 | CH?+CO?双用途利用 |
| 启动时间 | 较长（需厌氧氨氧化菌倍增） | 较长（厌氧氨氧化菌+n-DAMO） | 相对较长，但可通过微生物群转移缓解 |

主要参考文献：Lackner等，2014；Fan等，2023；Kim等，2018–2021；Lu等，2024

表5. AME-D/n-DAMO两阶段MBfR与现有旁流氮去除技术的对比

| 工艺类型 | 外部碳源 | 总氮去除率 | N?O排放量 | 生物气利用情况 | 副产物回收情况 |
|------------------------------|----------------|------------|-----------|----------------|----------------|
| 传统N/DN（序批式反应器） | 甲醇，2–4 kg/kg-N | 85–95% | 约10%的氮负荷 | 无 | 无 |
| SHARON–厌氧氨氧化工艺 | 无 | 80–90% | 变化范围为0.5–5% | 无 | 无 |
| ANITA? Mox MBBR工艺（基于厌氧氨氧化） | 无 | >90% | 小于3%的氮负荷 | 无 | 无 |
| AME-D/n-DAMO两阶段MBfR工艺（本综述） | 无（生物气CH?自供） | 预计>90% | 通过nosZ?管理可降至最低；目前尚无定量排放因子，需未来研究确定 | CH?+CO?双用途利用 | PHB、EPS、SCP等生物产物回收 |

注：EPS指胞外聚合物；MBfR指膜生物膜反应器；N/ND指硝化/反硝化；PHB指聚羟基丁酸酯；SBR指序批式反应器；SCP指单细胞蛋白；TN指总氮。

5. 结论

用AME-D工艺取代传统的PN阶段后，第一阶段便从单一的亚硝酸盐供应单元转变为多功能生物处理中心，能够同时实现铵盐去除、生物气中碳元素的利用，以及为下游的n-DAMO微生物群提供所需的碳中间体——这些功能是传统PN工艺所不具备的。废水和生物气的固有组成使得这些优势无需额外添加物质即可实现：微量金属可维持甲烷氧化酶的活性，生物气中的CO?有助于生物碳固定及pH值的自调节，而由三种微生物群构成的互喂网络则可实现无碳氮去除并同步产出生物产物。

该工艺的核心理念是将第一阶段视为生态调控的场所，而非NO?的产生源。Burkholderiales菌群具备耐氧性，能够在不同溶解氧条件下稳定产生亚硝酸盐；而不同优势菌株在N?O代谢途径上的差异，则为AME-D阶段提供了控制温室气体的内在机制。将上述功能与两阶段MBfR结构相结合，便可独立调控快速生长的甲烷氧化菌群与生长缓慢的n-DAMO/厌氧氨氧化菌群的生存压力。

目前，该工艺的长期稳定运行仍受到N?O排放、高浓度旁流条件下的膜污染以及稀土元素生物利用率低等因素的限制——稀土元素不足会抑制后续反应进程。这些问题可通过富集具有nosZ基因的菌株、有针对性地补充微量元素以及采用无气泡膜技术来部分缓解。不过，目前尚未有在真实旁流条件下的试点示范研究，因此无法直接将结果推广到全规模设计中。在能够宣称实现完全碳中和之前，还需进行定量的生命周期评估。其中，N?O问题尤为值得重视。根据IPCC AR6（2021）的报告，N?O的100年全球变暖潜能值为每千克273公斤二氧化碳当量，远高于甲烷的数值，即便排放量很小，也会对气候造成显著影响。在生物氮去除系统中，N?O往往占据系统温室气体排放总量的大部分（可达二氧化碳当量排放量的约78%，Daelman等，2015）。在旁流部分硝化及硝化-厌氧氨氧化工艺中，已报道的N?O排放因子约为进水氮负荷的0.2–5%，平均约为2%（Vasilaki等，2019）。由于AME-D/n-DAMO工艺同样依赖甲烷驱动的硝化过程，且其高溶解氧微梯度及短暂的亚硝酸盐积累条件有利于N?O生成，因此其在实际旁流条件下的排放因子很可能处于这一范围之内甚至更高；但目前尚未有直接量化研究，通过富集具有N?O还原能力的nosZ基因菌株来实现减排，在理论上虽有可能，但尚未得到实验验证。因此，我们暂不能给出确定的N?O控制方案。不过，鉴于N?O是该工艺中最具影响力的温室气体，也是决定其能否实现净碳中和的关键因素，我们认为，未来研究应优先开展N?O通量的实时连续监测，同时针对性地开发微生物群调控及操作策略以降低其排放，这 merupakan一项至关重要的任务。

未来的研究应重点在真实废水条件下进行试点验证，明确微量元素的生物利用效率，对多菌群生态系统进行功能工程改造，并结合氮去除、生物产物回收及碳核算，开展全面的生命周期评估。只有实现这些目标，AME-D/n-DAMO工艺才能真正成为下一代水资源回收技术，能够在同一处理流程中同时实现氮去除、温室气体减排以及循环生物经济模式的构建，从而弥补现有厌氧氨氧化工艺存在的诸多缺陷。

CRediT作者贡献说明：

I.-T. Kim：概念设计、研究实施、项目监督、初稿撰写、修订润色、数据整理。
Y. Jeong：项目管理、修订润色、数据整理。
Y.-E. Lee：可视化处理、修订润色。
K.-H. Ahn：修订润色。
J.-H. Jung：效果验证、修订润色。

数据可用性：数据将在请求时提供。

CRediT作者贡献说明：

I-Tae Kim：修订润色、初稿撰写、监督、研究实施、数据整理、概念设计。
Yoonah Jeong：修订润色、项目管理、数据整理。
Ye-Eun Lee：修订润色、可视化处理。
Kwang-Ho Ahn：修订润色。
Jin-Hong Jung：修订润色、效果验证。