《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Multifunctional-engineered NK cells overcome tumor immunosuppression by combining PD-L1 and HLA-E targeting and endogenous IL15 production
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免疫抑制肿瘤微环境（TME）对有效癌症免疫治疗构成重大挑战，因为它通过冗余的检查点通路、代谢限制和直接抑制效应细胞使肿瘤得以逃逸。为克服这些障碍，研究人员利用三顺反子逆转录病毒载体开发了下一代自然杀伤细胞（NK细胞）平台，该平台增强NK细胞的激活、募集、存活和
免疫抑制肿瘤微环境（TME）对有效癌症免疫治疗构成重大挑战，因为它通过冗余的检查点通路、代谢限制和直接抑制效应细胞使肿瘤得以逃逸。为克服这些障碍，研究人员利用三顺反子逆转录病毒载体开发了下一代自然杀伤细胞（NK细胞）平台，该平台增强NK细胞的激活、募集、存活和代谢适应性。泛癌症转录组分析揭示肿瘤中程序性死亡配体1（PD-L1）和人类白细胞抗原E（HLA-E）存在一致性共表达，该共表达与伴随强烈免疫抑制的免疫浸润相关，凸显了这些分子作为免疫逃逸关键靶点的作用。为改善TME中NK细胞的募集、激活、溶细胞功能、存活和代谢适应性，研究人员开发了下一代NK细胞平台，该平台使用三顺反子逆转录病毒载体，该载体编码一个与NKG2D和共刺激分子4-1BB的胞内部分融合的细胞外程序性死亡受体1结构域（exPD1），并表达可溶性白细胞介素15（IL15）和NKG2A单链可变区片段（scFv）。因此，exPD1允许识别表达PD-L1的细胞，而胞内共刺激信号将抑制性PD-1/PD-L1相互作用转化为激活性相互作用。该策略有效靶向PD-L1阳性肿瘤细胞，并诱导原本阴性的肿瘤中从头表达PD-L1。为进一步增强抗肿瘤活性，研究人员整合了一个编码可溶性NKG2A-scFv的模块，以遮蔽NK细胞上的NKG2A受体并阻碍NKG2A/HLA-E抑制性相互作用。此外，研究人员通过递送受控低剂量的IL15改善了NK细胞存活和扩增，这阻止了NK细胞耗竭并延长了其在体内的存在时间。这一整合策略可能提供一种新型、即用型的异体成熟NK细胞疗法，能够克服检查点介导的抑制、代谢抑制和免疫逃逸，为治疗高风险和耐药肿瘤提供有前景的模型。
**论文解读：多功能工程化NK细胞通过联合靶向PD-L1和HLA-E及内源性IL15克服肿瘤免疫抑制**
**研究背景与存在问题**
尽管多模式癌症治疗（包括手术、放疗和靶向化疗）取得了重大进展，但对晚期或转移性肿瘤患者的有效持久治疗仍是重大挑战。免疫治疗的出现带来了变革性策略，如单克隆抗体（mAbs）、治疗性疫苗和过继性免疫细胞移植，但临床经验表明，即使是最先进的细胞疗法（如嵌合抗原受体T细胞，CAR-T细胞）也常难以在难治/复发（R/R）肿瘤中实现持久缓解。疗效有限的主要原因是肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性、靶抗原的选择性丢失以及肿瘤驱动的免疫逃逸机制。CAR-T细胞疗法面临自体T细胞数量有限、生产周期长、成本高和潜在严重毒性（如神经毒性和细胞因子风暴）等障碍。此外，肿瘤细胞丢失靶抗原并上调免疫检查点配体（如程序性死亡配体1，PD-L1）和非经典人类白细胞抗原E（HLA-E）进一步损害疗效。自然杀伤（NK）细胞因其不依赖抗原识别、不引起移植物抗宿主病（GvHD）和细胞因子释放综合征（CRS）等优势，成为新一代过继肿瘤免疫治疗的有力候选。然而，NK细胞疗法面临基因修饰效率低、体外扩增困难以及TME中免疫检查点（如PD-1/PD-L1轴和NKG2A/HLA-E轴）的抑制等关键挑战。
**研究内容与意义**
为解决上述问题，研究人员开发了一种新一代NK细胞平台。通过三顺反子γ-逆转录病毒载体，对健康供者（HD）来源的成熟NK细胞进行工程化改造，使其表达细胞外PD-1结构域（exPD1）与NKG2D及4-1BB胞内共刺激域融合蛋白，同时分泌NKG2A单链可变区片段（scFv）和白细胞介素15（IL15）。该平台同时靶向PD-L1和HLA-E两个免疫逃逸关键分子，并通过自分泌IL15支持NK细胞存活和增殖。研究表明，该工程化NK细胞（exPD1-NK细胞）在体外和体内对多种血液和实体肿瘤（包括神经母细胞瘤、白血病、胰腺癌和髓母细胞瘤）展现出强大的抗肿瘤活性，并改善了代谢适应性和迁移能力。该研究提供了一种即用型、异体、现成的NK细胞疗法，有望克服当前免疫治疗中检查点冗余、代谢抑制和持久性差等局限，为高危和难治性肿瘤患者提供新的治疗策略。论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
**主要关键技术与方法**
研究人员使用的主要关键技术包括：（1）基于癌症基因组图谱（TCGA）和治疗应用研究产生有效治疗（TARGET）数据库的泛癌症转录组分析，评估PD-L1和HLA-E的表达及其与免疫浸润和免疫抑制基因特征的相关性；（2）构建三顺反子γ-逆转录病毒载体，利用2A肽序列共表达exPD1-NKG2D-4-1BB融合蛋白、NKG2A-scFv和IL15；（3）从健康供者（HD）外周血分离NK细胞，经IL1β、IL15和IL2短期激活后转导，建立高产量体外扩增方案；（4）通过流式细胞术、细胞毒性实验、活细胞成像、Seahorse细胞外通量分析（测量耗氧率OCR和细胞外酸化率ECAR）、蛋白质组学和基因集富集分析（GSEA）评估工程化NK细胞的功能、表型和代谢适应性；（5）体内实验使用免疫缺陷NSG小鼠模型，包括白血病（NALM-18）、神经母细胞瘤（SK-N-AS）和髓母细胞瘤（D283-Med）的异位和原位肿瘤模型，结合生物发光成像评估抗肿瘤活性和持久性；（6）利用患者来源的胰腺癌类器官（PDO）进行3D细胞毒性实验。样本队列来源包括TCGA成人肿瘤和TARGET儿童肿瘤数据，以及来自IRCCS Bambino Gesù儿童医院的健康供者。
**研究结果**
**PD-L1和HLA-E分子是开发有效NK细胞癌症治疗的关键**：通过分析TCGA和TARGET数据库，发现PD-L1和HLA-E在多种成人和儿童肿瘤中表达，且两者表达呈正相关。在免疫“热”（高免疫浸润）肿瘤中，PD-L1和HLA-E表达显著高于“冷”肿瘤，且与NK细胞浸润和免疫抑制基因特征呈正相关。这表明PD-L1和HLA-E在免疫浸润肿瘤中共同作用，抑制NK细胞抗肿瘤活性，提示同时靶向NKG2A-HLA-E轴和PD-L1免疫检查点的治疗潜力。
**exPD1/NKG2A-scFv/IL15载体的生成和表征**：研究人员设计了三顺反子γ-逆转录病毒载体，并验证其功能。在HEK-293T细胞中，转染后表达exPD1，分泌NKG2A-scFv（约28kDa），该scFv可有效遮蔽NK细胞上的NKG2A受体，并增强NK细胞对HLA-E
+肿瘤细胞的杀伤能力。同时，转染细胞分泌可检测的IL15，证实载体各组分成功表达和分泌。
**体外生成高产率、功能稳定的exPD1-NK细胞**：研究人员优化了从HD外周血快速扩增和转导成熟NK细胞的方案。转导后exPD1-NK细胞稳定表达PD-1，扩增倍数高于对照组（mock）。exPD1-NK细胞自身分泌NKG2A-scFv，可遮蔽自身及邻近NK细胞的NKG2A，并分泌低但足够量的IL15支持自身和异体NK细胞增殖。通过缺失突变体实验，证实IL15和NKG2A-scFv均对细胞存活和细胞毒性有重要贡献。蛋白质组学分析显示，在PD-L1刺激下，exPD1-NK细胞上调激活、细胞毒性和蛋白翻译/折叠相关通路。基因转移未影响关键激活受体（NKp46、NKp44、NKp30、NKG2D、DNAM-1）的表达。
**exPD1-NK细胞对多种血液和实体肿瘤表现出强抗肿瘤活性**：在4小时细胞毒性实验中，exPD1-NK细胞对PD-L1
+肿瘤细胞（如NALM-18、KARPAS、SK-N-AS、SK-N-SH）的杀伤能力显著高于mock-NK细胞，而对PD-L1
-肿瘤细胞（如HL-60、THP-1、IMR-32、SH-SY5Y）两者相似。在72小时活细胞成像中，exPD1-NK细胞显著抑制PD-L1
+ SK-N-AS肿瘤细胞增殖并诱导早期凋亡，对PD-L1
- IMR-32也有一定效果。在患者来源的胰腺癌类器官（PDO）3D模型中，exPD1-NK细胞显著抑制类器官生长，且观察到PD-L1在类器官表面上调，提示exPD1-NK细胞可通过克服HLA-E介导的抑制发挥抗肿瘤作用。
**exPD1-NK细胞在体内抑制血液和实体肿瘤生长**：在白血病（NALM-18）NSG小鼠模型中，单次静脉注射exPD1-NK细胞显著抑制肿瘤生长，降低骨髓中肿瘤细胞数量，并提高无事件生存率。在神经母细胞瘤（SK-N-AS）异位和原位模型中，exPD1-NK细胞同样显著延迟肿瘤生长，减少肿瘤体积和生物发光信号。在髓母细胞瘤（D283-Med）原位模型中，exPD1-NK细胞（无需外源IL15）显示出对肿瘤生长的部分控制，而mock-NK细胞需联合重组IL15。exPD1-NK细胞在脾脏和肿瘤中持久存在。血清生化分析和脾脏组织学评估未观察到明显毒性。
**exPD1-NK细胞在与肿瘤接触后改善代谢适应性和迁移能力**：高维表型分析显示，与mock-NK细胞相比，exPD1-NK细胞在基础状态和肿瘤接触后上调了与免疫激活、细胞黏附和迁移相关的表面分子（如CD148、CD53、CD69、CD31等）。在“热”和“冷”肿瘤中，这些分子对应的配体均有表达，提示exPD1-NK细胞可能具有浸润低免疫浸润肿瘤的能力。生存分析表明，某些配体低表达的肿瘤患者预后更差，而exPD1-NK细胞上调相应受体，可能改善疗效。Seahorse分析显示，与肿瘤共培养后，exPD1-NK细胞在应激条件下具有更高的耗氧率（OCR）和备用呼吸能力（SRC），表明其代谢适应性更强。
**总结与讨论**
本研究提出了一种新型NK细胞免疫治疗平台，通过三顺反子载体同时靶向PD-L1（利用exPD1转化抑制信号为激活信号）和HLA-E（利用NKG2A-scFv阻断NKG2A/HLA-E抑制轴），并赋予NK细胞自主IL15支持（自分泌促进存活和增殖）。该平台有效克服了TME中免疫检查点冗余、代谢抑制和持久性差等关键障碍。exPD1-NK细胞在体外和体内对多种血液和实体肿瘤（包括神经母细胞瘤、白血病、胰腺癌和髓母细胞瘤）展现出强效且持久的抗肿瘤活性，同时保持良好安全性。该研究为开发针对侵袭性肿瘤的通用、现成异体NK细胞疗法提供了概念验证。
**研究结论**：研究人员的研究引入了一种基于NK细胞的新型免疫治疗平台，该平台解决了当前策略的关键局限，包括免疫检查点冗余、代谢抑制和低持久性。通过同时靶向PD-L1和HLA-E，并赋予NK细胞自主IL15支持，研究人员为侵袭性癌症（尤其是在异体背景下）提供了一种多功能且强效的治疗框架。在治疗领域日益追求精准和适应性的背景下，exPD1-NK细胞可能为急需有效、现成解决方案的患者提供一种及时且变革性的方法。这一新治疗策略为开发创新性癌症免疫疗法提供了概念验证，该疗法能够克服当前非异体环境以及肿瘤介导的免疫抑制和肿瘤适应及逃逸免疫系统识别能力所带来的障碍。重要的是，由于不同肿瘤中存在多样的组成和相关抑制机制，这一新平台的有效性和潜在适应性可能为通过基因工程化NK细胞靶向多种肿瘤类型提供有价值的原理验证。
