综述：光镊技术在红细胞力学表征中的应用：综述

《Biosensors》：Mechanical Characterization in Red Blood Cells Using Optical Tweezers: A Review

　　

鉴于红细胞（RBC）是血液中含量最丰富的细胞，其形态与力学特性显著影响血液流变学行为，同时机体生理功能与健康状态的改变亦会调控红细胞的力学属性。因此，阐明红细胞的力学特性在生物医学领域具有重要的研究价值。光镊（OT）技术凭借非接触操控、皮牛级力灵敏度等独特优势，已成为测量与分析红细胞力学特性的核心手段。本综述首先概述红细胞的基础力学特性、光镊的力学传感原理及其基本操控模式，重点梳理变形指数、剪切模量等关键力学参数的测量方法与应用场景。进一步探讨光镊与拉曼光谱、荧光技术及微流控技术的联用策略——这类复合技术可实现力学数据与分子信息的同步获取，动态监测力学状态变化，解析外界刺激与生理调控机制，从而为疾病诊断、药物疗效评估及人工血液质量评价提供支撑。最后，综述讨论当前技术面临的挑战与未来发展方向。

1. 引言

红细胞作为人体血液中含量最高的细胞，在循环系统中与各类组织发生相互作用，其物理与生化特性是生物医学分析与临床诊断的核心指标，其中力学特性更是反映细胞生理功能与病理状态的关键参数，例如高变形能力可保障红细胞顺利通过直径小于3 μm的毛细血管。大量研究表明，红细胞力学异常与多种疾病密切相关：疟原虫感染会显著提升红细胞膜刚度，镰状细胞贫血导致红细胞变形能力大幅下降，糖尿病患者红细胞刚度升高。这些证据提示病理状态会改变红细胞的变形性、形状恢复能力、弹性、刚度及聚集性等力学特性，而此类力学特征可作为传统生化指标无法替代的潜在病理标志物，为疾病诊断与监测提供新维度，因此实现红细胞力学参数的精准定量测量成为生物医学研究的重要方向。

现有红细胞力学表征技术可分为群体水平与单细胞水平两类：群体技术包括微孔滤过法、激光衍射法、微流控技术与介电泳法；单细胞技术涵盖微管吸吮法、原子力显微镜（AFM）、微流控技术、布里渊显微术、磁扭转细胞计量法与光镊（OT）。各类技术均有其优势与局限，其中光镊凭借非侵入、无接触、亚皮牛级力操控能力，可对拉伸、旋转及细胞间相互作用力进行定量测量，因灵活性高、精度优异、光热损伤低及力灵敏度极高，成为揭示红细胞力学行为微观机制的有力工具。尽管已有综述涉及光镊在红细胞研究中的应用，但普遍存在对操控模式描述不足、力学参数计算公式缺失、联用技术覆盖不全等问题，本研究旨在系统梳理该领域的技术体系与应用进展，为领域内研究者提供参考。

2. 光镊对红细胞的操控

2.1 红细胞的力学特性

红细胞的独特力学特性源于其特殊的结构组成：成熟红细胞呈双凹圆盘状，直径约6~8 μm，边缘厚度2~2.5 μm，中心厚度0.8 μm，由外层磷脂双分子膜、膜下锚蛋白-肌动蛋白六角形支架网络及内部高浓度血红蛋白溶液三部分构成，共同维持形态稳定并决定力学行为。其力学特性可通过宏观参数、膜微观参数与流变学参数三类量化表征。

宏观参数中，变形程度可通过伸长指数（EI）、相对伸长率（ε）、变形指数（DI）与变形比（DR）表征，整体刚度由杨氏模量（E）反映。EI定义为拉伸后红细胞长轴与原长之比，ε为长度增量与原长之比，二者满足ε = EI ? 1；DI基于经典椭圆拟合方法计算，DI=0代表细胞呈圆形，DI=1代表完全拉伸，适用于微管吸吮、大通道微流控及激光衍射场景；DR为两垂直方向长度之比，适用于窄通道内 parachute 形变形的表征。杨氏模量基于赫兹模型从力-距离曲线推导，健康红细胞杨氏模量较低，病理状态下（如糖尿病、镰状细胞病、疟疾）显著升高，也可通过公式μ = E/[2(1+ν)]由杨氏模量换算得到剪切模量（μ）。

膜微观参数中，膜剪切模量（μ）反映膜抵抗剪切变形的能力，健康红细胞μ为2.4~11.3 μN/m，疟疾感染时可升高十倍；膜剪切黏度（η_m）与松弛常数（τ）通过拉伸后弛豫过程量化；膜弯曲模量（B≈1.6×10^?19N·m）通过局部膜弯曲实验获得，数值越高表明脂质双层抗弯曲能力越强。

流变学参数反映红细胞与血浆、其他血细胞相互作用的流动行为，包括聚集指数、聚集时间、聚集速率、聚集力、解聚力、电泳迁移率与悬浮黏度贡献，可用于评估血液黏度与血栓风险，例如系统性红斑狼疮患者红细胞聚集力接近健康人的两倍。

2.2 光镊技术

光镊技术的核心原理是利用高数值孔径物镜聚焦高斯光束，在焦点处形成三维梯度光强分布，入射光与微粒表面相互作用产生沿光束传播方向的散射力与沿光强梯度方向的梯度力，二者平衡时实现粒子稳定捕获。力测量主要基于三种方法：一是胡克定律（F = k·?x），适用于规则球形物体，需预先校准光阱刚度；二是斯托克斯定律（F_trap= 6πηrv），通过流体拖曳力平衡计算陷阱力，适用于规则与不规则物体；三是基于光动量变化的力传感方法，仅依赖检测仪器参数，不受样品尺寸、折射率与散射特性影响。

生物样品操控优先选择近红外激光（如1064 nm），以降低光吸收、局域产热与光损伤风险。光镊系统可分为传统光镊与全息光镊（HOT）：传统光镊由近红外激光器、扩束镜、高数值孔径（NA≥1）浸油/水物镜与三维纳米平移台构成，单光阱配置下可通过声光偏转器或多面镜扫描实现多阱时分复用，但阱数量受限且相邻阱串扰难以避免；全息光镊通过在光路中插入空间光调制器（SLM），利用液晶像素阵列调制波前相位，可生成数十个独立动态光阱，毫秒级刷新率支持并行三维操控，是单细胞力学表征的理想工具。两类系统均可通过施加外力并监测实时形变，解析红细胞在不同应力下的力学响应与结构机制，主要操控模式分为直接操控与间接操控两类。

2.3 直接操控

直接操控研究中，红细胞通常悬浮于0.9%氯化钠溶液、无Mg²⁺与Ca²⁺的0.01 M磷酸盐缓冲液或血浆中，样品池预先经牛血清白蛋白（BSA）或多聚赖氨酸包被以防止细胞黏附。光阱数量决定红细胞取向：1~2个光阱时，光学扭矩驱动红细胞旋转，光束焦点稳定在细胞最厚区域；≥3个光阱时，红细胞可稳定保持平躺状态。常用操控方法包括单光镊拖拽与多光镊拉伸。

单光镊拖拽操作中，光阱捕获红细胞一端，在流体剪切力作用下细胞可逆地从双凹盘状变形为子弹状，通过形变后长度变化可计算膜剪切弹性μ、形状恢复弛豫时间τ与膜黏度η_m，该类方法自1987年提出以来已成熟应用于膜弹性测量、激光损伤评估、储存损伤分析及镰状细胞贫血、地中海贫血等疾病研究，但存在通量低的局限。

双光镊与多光镊拉伸操作通过固定阱与移动阱配合施加拉伸力，可测量变形指数、刚度、剪切模量与弛豫时间等参数。为降低光损伤，研究开发了“拔河式”光镊配置，通过SLM生成发散 elongated 光束，20 mW功率即可实现15 pN陷阱力，效率较传统双高斯光束阱提升近一倍。通过调控光阱移动速度可建立变形指数与细胞形态的关联，实现细胞分类；结合有限元模拟可解析变形红细胞表面应力分布。多阱配置进一步拓展了操控维度：三阱可诱导红细胞形成“降落伞”形，获得角度弛豫时间这一形状恢复动力学新指标；四阱全息光镊可对称拉伸红细胞，同步监测多方向形变与受力，构建了多维度的红细胞力学分析框架，为血液疾病诊断、放疗监测与输血质量评估提供关键生物力学指标。

2.4 间接操控

间接操控通过将功能化微球偶联至红细胞膜表面作为“手柄”，由光镊捕获微球施力，可减少光损伤并避免细胞翻转，便于同步采集侧向与轴向形变图像。样品制备中，早期使用未修饰二氧化硅或聚苯乙烯微球（直径1~4 μm），后期发展为IgG、羧基、链霉亲和素或氨基功能化微球以提升结合特异性与稳定性；力校准方法也从流体动力学法演进为玻尔兹曼统计法与热波动分析法，精度从纳牛级提升至皮牛级。

1999年提出的双微球偶联策略包含两种模式：“单阱牵引-单球锚定”与“双阱捕获-锚定平移”，通过增大两阱间距施加梯度拉力，基于小变形下受力与极径变化的关系计算剪切模量μ；同期发展的“固定-平移”双阱配置结合帕克轴对称壳弹性理论，可计算弯曲模量B与剪切模量H，奠定了红细胞剪切模量计算的基础。后续研究通过构建双凹形红细胞有限元模型克服早期球形简化假设的局限，引入微球高度校正提升大变形（~193 pN）下数据可靠性，开发微球压痕法测量侧向膜刚度，与微管吸吮结果一致且避免强细胞-基底相互作用。可测参数已从单一的小变形剪切模量拓展至大变形剪切模量、弛豫时间、细胞间黏附力、表观膜黏度、刚度、膜波动功率谱密度及拉伸过程中细胞高度动态变化等多维指标。

3. 光镊与其他技术联用在红细胞研究中的进展

单一光镊技术仅能获取力学参数，联用技术可实现多维度信息同步采集。光镊与拉曼显微光谱联用（LTRS）中，一束激光用于光捕获施力，另一束用于拉曼信号检测，可同步分析红细胞力学与化学特性：研究发现β-地中海贫血红细胞膜剪切模量较正常细胞高40%，携氧能力下降；该技术也已应用于疟疾、镰状细胞病、糖尿病的研究，展现出诊断潜力。针对拉曼信号弱与光损伤的权衡难题，光片拉曼光镊系统采用单激光束同时实现拉曼激发与光捕获，将功率密度降至3.8×10⁴W/cm²，较传统系统降低七倍；间接拉伸策略通过微球偶联减少激光直接照射细胞，发现变形超过10%时血红蛋白与蛋白质振动模式的拉曼峰强度显著升高，提示外力可改变胞内分子化学结构。

光镊与荧光显微光谱联用弥补了传统光镊无法三维成像的缺陷：共聚焦荧光显微光谱集成实现了红细胞的荧光成像与动态追踪，揭示激光诱导的细胞取向与偏振方向一致而非折叠成杆状；联用流式细胞术证实纤维蛋白原在细胞接触区富集，糖蛋白受体IIbIIIa（GPIIbIIIa）介导的黏附主导红细胞聚集，且该过程可被GPIIbIIIa抑制剂阻断；结合共聚焦显微镜发现膜系链主要由脂质双层支撑，系链区域无F-肌动蛋白荧光信号。但需注意光捕获激光会加速荧光染料光漂白，缩短观测窗口。

光镊与微流控技术联用结合了光镊的高精度操控与微流控的高通量优势：集成周期性斩波激光束与微流控通道可实现连续输送过程中红细胞的非接触拉伸；带释压结构的多通道微流控芯片结合时分复用光镊，通量达100 cells/min，捕获效率>90%，揭示病理红细胞膜 stiffening 现象；基于逃逸速度差异的联用系统对健康与地中海贫血红细胞的分选效率达95%；人工智能（AI）引导的光镊系统在多通道微流控中实现循环肿瘤细胞与红细胞的自动化无标记分选，纯度达100%。但该方法在复杂异质生物样本中的可行性仍需验证，微流控芯片材料可能引入额外光学干扰。

4. 光镊在红细胞研究中的应用

4.1 细胞间相互作用力的测量与研究

光镊从单细胞操控拓展至多细胞群体力学研究，双阱与四阱配置是经典的红细胞聚集特性研究方法：双阱分别捕获两个红细胞并提升至池底上方40 μm，通过调节光功率与拉动双阱测量二聚体聚集力（F_A）与解聚力（F_D）；四阱全息光镊可施加垂直于盘面方向的力，模拟全接触下的“碰撞-分离”过程，更贴近生理状态。相关研究已揭示激光辐射、纳米颗粒、红细胞寿命、黏附因子对细胞相互作用的调控效应。此外，光镊细胞撕裂操作仅需微量指尖血即可实现细胞表面抗原变异的高灵敏定量分析，也可用于解析红细胞与内皮细胞的相互作用机制；通过“红细胞-疟原虫-红细胞”三元系统，高精度测量红细胞-裂殖子黏附力，推翻了PfMSP1蛋白主导恶性疟原虫初始附着的传统认知，证实Dantu血型红细胞通过提升膜张力而非降低黏附抵抗裂殖子入侵，为疟疾疫苗靶点筛选提供关键力学证据。但现有研究多为体外稀释样本实验，无法复刻体内血流的剪切力、血浆成分复杂性及多组分相互作用，且部分研究以激光功率替代绝对力测量，降低了结果可比性。

4.2 红细胞生物信息学研究

光镊结合生化分析方法，推动红细胞生物信息研究从定性机制探索走向定量表征：研究证实Ca²⁺内流与磷脂酰丝氨酸外翻（而非溶血磷脂酸）是红细胞不可逆黏附的主因；GPIIbIIIa抑制剂可显著降低聚集力，揭示蛋白依赖性调控机制；明确了纤维蛋白原、白蛋白等不同血浆蛋白对聚集的差异化调控作用；发现一氧化氮通过可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）通路调控红细胞-内皮黏附，且呈L-精氨酸浓度钟形依赖关系。红细胞寿命研究显示聚集力随细胞年龄增长而升高，不同密度红细胞的剪切模量存在显著差异，密度梯度离心可有效降低样本异质性，但Percoll梯度分离反映的是密度而非精确细胞年龄，“年轻”与“衰老”红细胞的分类仍需进一步验证。此外，不同形态红细胞与不同物种红细胞的变形指数及拉曼光谱差异，为极端环境下红细胞的适应性机制研究提供了新视角。

4.3 不同外界环境刺激对红细胞的影响研究

光镊技术可解析复杂微环境下红细胞的内在力学特性：激光辐照研究中，785 nm近红外光比较1064 nm更易诱导红细胞 stiffening，可见光辐照通过血红蛋白结合氧的光解离触发氧化损伤，连续低剂量450 nm照射提升变形性，短脉冲He-Ne照射降低聚集力，高剂量辐照后变形指数下降，可作为辐射响应的潜在生物标志物。渗透应激研究显示，红细胞剪切模量与刚度随渗透压升高而增大，变形性排序为低渗>等渗>高渗，拉曼光谱进一步揭示渗透变化通过改变胞内血红素浓度、重构膜结构与诱导蛋白质构象变化调控整体力学响应。化学刺激研究中，双酚A损伤膜与血红蛋白结构，乙醇暴露诱导脱氧与不可逆形态丢失，过氧化氢提升剪切模量并降低变形性，为环境毒理学与血液疾病机制研究提供依据。纳米材料生物相容性研究中，金、银纳米颗粒诱导膜力学改变，聚合物纳米颗粒与氮化物等离子体纳米颗粒对红细胞相互作用干扰微弱，为纳米药物载体设计提供指导。机械疲劳研究显示，重复拉伸导致红细胞刚度升高、恢复时间延长，验证了“拉伸诱导刚度增强”与“流变不可扩展性”的普遍规律，揭示累积机械应变驱动红细胞流变性能退化的机制。但现有机制解释多基于力学表征、拉曼位移或形态学推断，缺乏膜骨架蛋白、ATP水平、氧化损伤标志物、血红蛋白氧亲和力与离子通道功能的直接验证。

4.4 血液相关疾病研究

光镊联用技术广泛应用于红细胞相关疾病研究：地中海贫血患者的红细胞携氧能力下降40%，刚度升高，弹性降低，膜黏度升高，膜表面负电荷减少，提示疾病损伤膜结构（如表面糖蛋白、细胞骨架相关带3蛋白）导致力学与电学特性改变。镰状细胞病（SCD）中，HbS突变导致红细胞刚性增加、变形性降低，储存期间镰状细胞 trait（HbAS）供体的弹性模量显著升高，羟基脲（HU）治疗可恢复变形性；1064 nm光阱可无创测量折叠角、旋转特征与变形弛豫时间，HU治疗后差异更显著；拉曼光镊显示SCD红细胞在机械应力下更易脱氧；甘露糖结合凝集素（MBL）通过结合膜结构改变膜与细胞骨架，提升HbSS红细胞膜稳定性并降低弹性，揭示免疫分子对红细胞力学的调控作用。其他血液疾病如急性髓系白血病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、遗传性椭圆形红细胞增多症、缺铁性贫血的力学研究仍相对有限。

4.5 非血液系统疾病研究

非血液系统疾病同样显著影响红细胞微环境与力学特性：疟疾感染阶段，受染红细胞剪切模量可升高十倍，膜骨架局部 stiffening 与Skalak本构模型数值计算结果吻合，肝素可显著降低裂殖子黏附强度与入侵率；Dantu血型红细胞膜张力（1.22×10^?6N/m）高于普通红细胞，入侵阈值约3.8×10^?7N/m，高张力是抵抗入侵的核心机制；基因敲除结合光镊技术证实PfEBA/PfRH蛋白家族（而非PfMSP1）主导黏附过程，阐明疟疾入侵的分子生物力学机制。心血管疾病患者中，高血压者红细胞聚集时间缩短24%，解聚力升高28%，F_D/F_A比值具有诊断价值；冠心病患者聚集时间缩短27%，合并2型糖尿病（T2DM）者聚集性更强。糖尿病研究中，2型糖尿病与糖尿病视网膜病变患者红细胞DI显著降低，且与初始细胞大小负相关；基于光镊的双时间分辨膜波动光谱显示妊娠糖尿病胎儿红细胞膜张力与弯曲模量升高；785 nm拉曼光镊结合PCA-LDA模型对糖尿病红细胞的分类准确率达100%；急性高糖暴露通过增强氧化应激降低膜弹性，伸长率随葡萄糖浓度升高而下降，为糖尿病早期诊断提供新方法。

4.6 药物评价与研发

药物通过血液循环作用于全身，也会影响红细胞力学特性。联用荧光成像与流式细胞术的研究显示，锂盐（双相情感障碍一线治疗药物）、维生素E（储存红细胞抗氧化剂）、多柔比星（急性髓系白血病化疗药物）均可降低红细胞膜弹性与刚度，为药物细胞毒性机制研究提供新的生物物理证据。拉曼光镯研究发现，常用静脉输注溶液（0.9%盐水、乳酸林格液、Plasmalyte-A）诱导血红蛋白脱氧，损害携氧能力，而血浆中的红细胞抗脱氧性能更优；羟乙基淀粉则同时损伤红细胞氧合状态与膜结构。这提示在评估药物对红细胞的影响时，不应将生理盐水等晶体液视为“无影响背景”，建议采用血浆或更接近生理的对照条件，以避免药物效应与稀释效应的混淆。

4.7 人工红细胞质量评价

培养红细胞（cRBCs）是解决血液供需矛盾的重要方向，但其形态与力学特性与原生红细胞（nRBCs）存在差异，需高精度评价。振荡光镊系统采用沙漏形光阱捕获cRBCs并施加轴向振荡，通过分析高频散射信号与膜波动发现，人血小板裂解液培养的cRBCs生物力学特性最接近nRBCs，与数字全息显微镜测量结果一致；联用光镊-原子力显微镜-扫描电镜分析显示，cRBCs膜弹性与蛋白质表达虽与nRBCs相当，但脂质缺乏导致形态与力学缺陷，证实光镊是人工红细胞质量评价的关键工具。但现有结论多基于体外单细胞实验，细胞成熟度、异质性及测量方法可能影响力学参数，需进一步通过因果脂质干预、高分辨率膜骨架分析及体内模型验证力学相似性与质量评价的关联性。

5. 结论与展望

光镊技术已成为红细胞力学研究的核心工具，发展历经三个关键阶段：从基础操控到性能优化系统，从单一技术到多技术联用实现多维分析，从健康细胞研究到疾病诊断应用，揭示了红细胞全局与局部力学特性的关联及相互作用机制，为医学诊断提供了新视角。但当前技术仍面临多重挑战：研究多集中于红细胞高相关疾病（如镰状细胞病、疟疾、糖尿病），阿尔茨海默病等相关性较低但具潜在价值的疾病研究不足；临床样本匮乏导致缺乏大样本标准参考值，限制临床应用；虽已实现斑马鱼尾动脉与小老鼠耳廓毛细血管内的红细胞操控，但生物组织多重光散射导致高斯光束无法在人体深部形成有效光阱，体内操控尚不可行；最重要的是多数光镊系统通量低，难以满足快速临床检测与大规模研究需求。

未来发展方向逐渐明晰：体外研究方面，结合体外人工红细胞培养技术与基因编辑、膜组分可控变量分析，可降低样本来源复杂性，助力机制解析；体内研究方面，通过波前调控增强激光聚焦以解决生物组织强散射问题，为体内操控提供可能，推动诊断应用转化；标准化建设方面，需积累大量实验数据以确定标准方法与诊断指标范围。此外，光镊与人工智能（AI）的融合极具潜力：AI图像分析可批量提取红细胞形态数据，大幅缩短处理时间，适配光镊-微流控高通量检测；深度学习模型可对多维力学参数进行特征分析，实现多参数提取与高灵敏判别；机器引导细胞分离（MaGIC）系统可实现多通道目标细胞无操作员捕获与分选，推动技术自动化。总体而言，光镊可实现红细胞力学参数的多维度表征，有望作为物理生物标志物支撑基础研究与疾病诊断，但在体内应用、通量与标准化方面仍需突破。